电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制

国海东,邵水金,朱晶,陆萍萍



电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆力改善及海马神经元损伤保护的作用及机制

国海东,邵水金,朱晶,陆萍萍

(上海中医药大学基础医学院解剖教研室,上海 201203)

探讨电针保护海马神经元和改善阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠学习记忆力的作用机制。将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组,采用Morris水迷宫检测空间学习和记忆能力的变化。Hoechest33342染色观察各组海马神经元的凋亡;Western blot检测Bcl-2和Bax的水平;免疫组织化学染色分析Caspase-3阳性神经元的个数和光密度值。电针治疗可明显提高AD大鼠学习和记忆功能,并可降低海马CA1区凋亡细胞的数目、上调Bcl-2的表达和下调Bax和凋亡执行蛋白Caspase-3的表达。电针可通过调节Bax和Bcl-2的平衡比值,降低Caspase-3的表达,对抗b-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡,改善AD大鼠学习和记忆功能。

针刺疗法;电针;阿尔茨海默病;大鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种渐进性的中枢神经系统的退行性变性病,以进行性记忆障碍、全面智能减退、个性改变以及精神行为异常为主要临床表现,给患者、患者家属以及整个社会带来沉重的负担。AD已是继心血管疾病和肿瘤之后的老年人死亡的第三大病因[1]。在病理学上,AD以细胞外b-淀粉样蛋白(amyloid-b,Ab)沉积形成的老年斑、细胞内的神经原纤维缠结和神经元及其突触的缺失为典型特征,胆碱能神经元的丢失是引起进行性记忆和认知功能减退的根本原因。由于现代医学对本病的发病原因和发病机制尚未充分阐明,相关治疗药物缺乏很好的特异性,临床疗效十分有限[2]。中医学对AD的病理论述较为丰富[3]。针对AD复杂的多因素致病,中医针灸治疗具有多层面、多途径、多靶点作用的优势[4]。目前,诸多动物实验和临床试验研究显示,中医针灸具有较好地治疗AD的作用[4]。然而,针灸治疗对AD的具体作用机制目前尚不十分清楚。本研究在构建AD大鼠模型的基础上,采用电针治疗,继而从行为学、组织病理学与分子生物学等多方面探讨电针保护海马神经元和改善学习记忆力的作用机制,以期为AD的临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象

SPF级SD大鼠,体重(200±50)g,由上海中医药大学实验动物中心提供;Ab1-40购自美国Sigma公司;兔抗大鼠Bcl-2/Bax多克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记二抗均购自美国Santa Cruz公司;Hoechest33342染色购自碧云天生物技术研究所;SABC试剂盒购自美国Vector公司;生物素化山羊抗兔IgG购自美国Jackson Immuno Research公司;立体定位仪(江湾Ⅰ型)为第二军医大学生理教研室研制;Morris水迷宫为中国医药科学研究院研制。

1.2 AD动物模型建立

10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,将头颅固定在脑立体定位仪上,消毒手术区皮肤,做正中切口暴露前囟,参照大鼠脑立体定位图谱,以前囟为原点,向后3.5 mm,旁开2.0 mm为钻孔点,钻开左右两个对称的小孔,自脑颅骨表面进针3.0 mm至海马,用微量进样器抽取2ml(10mg)Ab1-40(37℃孵育1星期,使其变为聚集状态[5]),每点注射lml(5mg),缓慢进针,5 min内注射完毕,注射完毕后停针5 min,缓慢拔针,缝合皮肤,术后肌肉注射青霉素,连续3 d,以防感染。假手术组注射等量生理盐水。

1.3 分组及治疗

7 d伤口完全愈合后,饮食正常,无肢体残疾,即开始治疗。实验分正常组、假手术组、模型组和电针组4组,每组20只。在电针组,取百会(顶骨正中)和涌泉(于大鼠足底大趾与次趾之间向后2 mm处),采用0.35 mm×13 mm不锈钢毫针,百会穴平刺约2.5 mm;涌泉穴直刺进针1.5 mm;连接G6805A型电针治疗仪,选择连续波,频率为20 Hz,强度以肢体抖动,且大鼠能安静耐受为度。针刺治疗每天1次,每次30 min,7 d为1个疗程,疗程间休息1 d,共治疗4个疗程。正常组、假手术组及模型组正常饲养,不予电针治疗。

1.4 空间学习记忆力测试

采用Morris水迷宫测试大鼠逃避潜伏期和通过原平台次数以检测大鼠空间学习和记忆能力的变化[6]。历时5 d,每天分别从2个不同的入水点将大鼠放入迷宫中,记录其70 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期)。若大鼠入水后70 s内未能找到平台,则将其置于平台上并停留20 s,引导学习记忆,逃避潜伏期记录为70 s。实验第6天撤除平台,将大鼠面向池壁从任一入水点放入水池,测试70 s内跨越原平台位置的次数。Morris水迷宫测试期间仍按2.2部分对大鼠进行治疗处理。

1.5 Hoechest33342染色

Morris水迷宫测试完成后,部分动物经10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打开腹腔,暴露心脏,将注射针头插入左心室,剪开右心耳,快速灌注4℃生理盐水,待右心耳处流出澄清液体,换4℃多聚甲醛灌注到大鼠四肢强直,快速断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛中固定24 h,然后进行乙醇系列脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。所有标本均以注射点为中心做连续冠状切片,片厚5mm,所有切片均包含海马区。取各组切片,脱蜡、水化后,滴加Hoechest33342染色液,室温染色10 min,在荧光显微镜下观察各组海马神经元的凋亡情况。

1.6 Western blot检测Bcl-2和Bax的水平

部分动物颈椎脱臼处死,快速取出海马组织,加入RIPA buffer裂解液,提取总蛋白。按常规方法灌制聚丙烯酰胺凝胶,微量加样器加样后电泳。在半干转印仪上转膜30 min。取出PVDF膜,封闭液封闭2 h。倒掉封闭液,分别与一抗、二抗孵育,同时以GAPDH作为内参照。免疫印迹化学发光显色,X片曝光,洗片。将胶片进行扫描,用凝胶图像处理系统分析,计算蛋白质的相对表达量,方法为待测蛋白质的净像素值/GADPH的净像素。

1.7 Caspase-3染色组织化学染色

取各组切片,脱蜡、水化后,3%H2O2灭活内源性酶,蒸馏水洗涤,微波修复抗原;滴加正常山羊血清封闭液,室温下反应20 min;分别滴加浓度为1:200的兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体,湿盒中孵育过夜,PBS冲洗3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37℃孵育30 min,滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC),湿盒中孵育20 min,DAB显色,光镜下控制显色深度,脱水、透明、封片。以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。用图像分析软件,对每只大鼠脑相同间隔的3张切片,每张切片各测5个视野,在相同的放大倍数(400×)、视场面积和背景光强度下,分别对各组大鼠海马CA1区的Caspase-3阳性神经元进行计数。并运用图像分析软件测量各个视野Caspase-3阳性细胞的光密度值,计算每张切片的平均光密度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS15统计软件处理数据,各组间的差别采用单因素方差分析进行比较,结果用均数±标准差表示,以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

与正常组相比,AD模型组的平均逃避潜伏期时间显著延长,撤除平台后,AD模型组大鼠跨越原平台的次数减少,两组比较差异均具有统计学意义(＜0.01);与模型组相比,电针组大鼠逃避潜伏期的时间明显缩短,跨越原平台的次数明显增加,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示电针有改善AD大鼠学习和记忆能力的作用。详见表1。

表1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.2 各组大鼠海马CA1区细胞凋亡指数比较

Hoechest33342染色结果发现,正常组大鼠海马CA1区仅可观察到极少量凋亡细胞,而Ab注射可显著增加CA1区凋亡细胞数目,模型组与正常组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。电针组海马CA1区凋亡细胞的数目明显降低,与模型组相比,差异具有统计学意义(＜0.01)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠Hoechest33342染色结果

表2 各组海马CA1区细胞凋亡指数比较 (±s,%)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.3 各组大鼠海马Bcl-2和Bax表达比较

由表3可见,模型组大鼠海马组织中Bcl-2蛋白表达相对值较正常组显著降低(＜0.01);电针组大鼠海马组织中Bcl-2蛋白表达相对值与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.01),提示电针治疗可上调Bcl-2蛋白的表达。模型组大鼠海马组织中Bax蛋白表达相对值较正常组显著增高(＜0.01);与模型组相比,电针组大鼠海马组织中Bax蛋白表达相对值与模型组比较,差异具有统计学意义(＜0.01),提示电针组可下调Bax的表达。

表3 各组大鼠海马Bcl-2和Bax表达比较 (±s)

注:与模型组比较1)＜0.01

2.4 电针治疗对大鼠海马CA1区Caspase-3表达的影响

Caspase-3阳性反应产物主要沉积在海马CAl和CA3区锥体细胞层,呈棕黄色或棕褐色细颗粒状。由表4可见,模型组Caspase-3阳性细胞和平均光密度值与正常组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。电针组Caspase-3阳性细胞和平均光密度值与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01),提示电针组Caspase- 3阳性神经元数量明显减少,阳性反应产物的平均光密度值显著降低。

表4 各组大鼠海马CA1区Caspase-3阳性细胞计数及Caspase-3阳性产物平均光密度值比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

3 讨论

中医学对AD发病机理有着宝贵的经验[3]。中医学认为本病的发生与肾精亏虚、髓海失充有关,故肾虚血瘀、神明失养是其基本病机。经络是构成脑髓气血津液运行的通道,输送精髓充实于脑,并为传达脑神到人之五脏百骸之通路。根据“补肾通督、醒神益智”治疗原则,结合经络理论《难经·二十八难》:“督脉者……上至风府,入属于脑”,本实验选用督脉要穴百会和涌泉配伍治疗,百会通督醒脑,涌泉为肾经之根,两穴合用,既可补肾益髓,又可活血化瘀、开窍醒神,起到贯通气血、疏通督脉和补肾益髓的作用。动物实验和临床证明,中医针灸具有较好地治疗AD的作用[4]。本实验也发现,AD大鼠给电针治疗后,在迷宫实验中,逃避潜伏期时间明显缩短,同时穿越原平台次数明显增加,表明电针可改善Ab1-40诱导的AD大鼠的学习和记忆功能。

神经元凋亡是造成AD神经元丢失的主要途径,同时也是引起进行性记忆和认知功能减退的根本原因。本研究发现,在正常组,大鼠海马CA1区仅可观察到极少量凋亡细胞;而Ab注射可显著增加CA1区凋亡细胞数目。电针治疗可明显降低海马CA1区凋亡细胞的数目;与模型组相比,电针组凋亡细胞数目明显减少。本实验表明AD大鼠予以电针治疗可能通过拮抗Ab的神经毒性作用,保护神经元对抗凋亡,进而减轻AD的病理改变。

细胞凋亡不仅为机体维持正常生理所必需,而且与许多疾病的发生密切相关。Bcl-2可抑制多种类型的细胞凋亡,促细胞生存。而Bax是与Bcl-2功能相拮抗的一个基因,可促进凋亡发生。Bax和Bcl-2作为一个平衡体系,它们表达的比率在很大程度上影响着凋亡的发生[7]。研究表明,AD脑神经元凋亡过程中Bcl-2家族扮演着重要角色。Ab处理可诱导氧化应激,从而导致PC12细胞死亡。然而,转染抗凋亡基因Bcl-2的PC12细胞抗损伤能力增强,其机制可能与Bcl-2促使过氧化氢酶的表达和活化,有效清除自由基有关[8]。本研究发现,Ab1-40海马注射后,可诱导大鼠海马结构Bcl -2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高;同时电针治疗组Bcl-2表达较模型组增高,而促凋亡蛋白Bax表达较模型组降低。因此,我们推测电针抑制Ab神经毒性的机制可能与促进Bcl-2的表达和抑制Bax的表达有关,电针通过调节Bax和Bcl-2之间的平衡,减少神经元凋亡和丢失。

细胞凋亡虽然受高度程序化调控,但是其最终都是通过凋亡执行蛋白Caspase-3实现[9]。在正常状态下,细胞内Caspase-3以无活性的酶原形式存在于细胞浆。细胞凋亡时Caspase-3活化并且其表达随着凋亡的不同阶段发生重分布,在细胞凋亡的最后执行阶段,Caspase-3进入细胞核,酶切细胞核内下游底物,促使染色质凝聚和核酶激活,导致细胞凋亡[10-11]。本实验结果显示,正常组仅有少量的Caspase-3阳性神经元,而模型组Caspase-3阳性神经元数量明显增多,阳性反应产物着色显著加深,平均光密度值较对照组显著增高。与AD模型组相比,电针组Caspase-3阳性神经元数量明显减少,阳性反应产物的平均光密度值显著降低。结果表明电针治疗可下调Caspase-3的表达,从而抑制Ab诱导的神经元凋亡,这可能是其抗细胞凋亡作用机制的环节之一。

综上所述,电针治疗可通过上调海马结构抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax的表达,调节Bax和Bcl-2的平衡比值,降低凋亡执行蛋白Caspase- 3的表达等环节,对抗Ab诱导的神经元凋亡,提高AD大鼠学习记忆功能。本研究可为推广电针治疗AD以及阐明电针治疗AD的作用机制提供理论基础和实验依据。

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Mechanism of Action of Electroacupuncture in Improving Learning and Memory and Protecting Injured Hippocampal Neuron in Alzheimer’s Disease Rats

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,,201203,

To investigate the mechanism of action of electroacupuncture in improving learning and memory and protecting injured hippocampal neuron in Alzheimer's disease (AD) rats.The rats were randomized into normal, sham operation, model and electroacupuncture groups. Spatial learning and memory were assessed using a Morris water maze. Change of learning and memory abilities was detected by Morris water maze. Apoptosis of hippocampal neurons was examined by hoechest 33342 staining. Bcl-2 and Bax levels were measured by Western blot analysis. The number and optical density value of Caspase-3-positive neurons were determined by Immunohistochemical staining.Electroacupuncture can significantly improve AD rat learning and memory function, and reduce the number of apoptotic cells in the hippocampal CA1 region, upregulate the expression of Bcl-2 and downregulate the expressions of Bax and apoptosis execution protein Caspase-3.Electroacupuncture can improve AD rat learning and memory function through regulating the balance ratio between Bax and Bcl-2, reducing Caspase-3 expression and counteractingb-amyloid protein-induced neuronal apoptosis.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Alzheimer’s disease; Rats

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.09.682

1005-0957(2012)09-0682-04

国家自然科学基金项目(81102670);上海市教育委员会预算内科研项目(2010JW03);上海市教育委员会重点学科建设项目(J50301)

国海东(1981 - ),男,助理研究员,博士

2012-05-30