高效液相色谱法测定饲料中氟喹诺酮类药物

谭美英 隆雪明 邓云波 武深树

(湖南省兽药饲料监察所，湖南 长沙 410006)

氟喹诺酮类(fluoroquinolones，FQNS或FQS)药物，属于第三代喹诺酮类抗菌药，该药物具有吸收好，组织浓度高，半衰期长，抗菌谱广等优点，已成为医疗和兽医临床上的常用药物。我国明文规定不得在饲料中添加氟喹诺酮类药物。为确保人民的身体健康，有效打击饲料中非法使用兽药的行为，建立简便、快速、准确、灵敏度高的检测方法，测定饲料中氟喹诺酮类的含量显得尤为重要。目前，我国现有鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定、动物性食品中氟喹诺酮类药物残留量的测定等的相关标准，但还没有饲料中氟喹诺酮类仪器检测方法的相关标准。

本文建立了高效液相色谱对饲料中氟喹诺酮的测定方法。该方法简单、快速、准确、灵敏度高。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一级水的规定。甲醇：色谱纯；乙睛：色谱纯；氨水、磷酸、三乙胺、氢氧化钠；达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星对照品（纯度≥99.0%）；氟喹诺酮标准储备液：称取达氟沙星对照品10.0 mg，恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星（精确到0.1 mg）对照品各50 mg，用0.03 mol/l氢氧化钠溶液溶解并定容到50 ml容量瓶中，于4℃冰箱内贮存。氟喹诺酮工作液：用移液管分别准确移取标准储备液，用流动相分别稀释配成恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/ml，达氟沙星为 0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/ml的标准工作液，微孔滤膜，混合型阴离子固相萃取柱（100 mg/3 ml），提取液:2%氨水水溶液；0.03 mol/l氢氧化钠溶液。

1.2 仪器与设备

分析天平：感量0.00001 g和0.0001 g；固相萃取装置；旋涡混匀器；离心机；超声波清洗机；pH计精度为0.02；高效液相色谱仪。

1.3 液相色谱条件

荧光检测器检测，激发波长280 nm，发射波长450 nm；色谱柱：C18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm，或性能类似的色谱柱；流动相：缓冲溶液（0.05 mol/l磷酸/三乙胺溶液：取浓磷酸3.4 ml，用水稀释至1000 ml，用三乙胺调pH值至2.4）+乙睛=17+83(V+V)；流速：1 ml/min；进样量：20 μl。

1.4 样品前处理

准确称取试样5 g（精确到0.001 g），置于50 ml离心管中，准确加入25 ml提取液，涡旋振荡2 min，超声提取10 min，于5000 r/min离心5 min，重复提取一次，合并上清液，旋涡混匀备用。将SPE柱依次用甲醇、2%氨水水溶液各3 ml活化，取上清液（配合饲料10.00 ml、预混料和浓缩料5.00 ml）过柱，用2%氨水水溶液、甲醇溶液各3 ml淋洗，抽干，用流动相4.00 ml洗脱，收集洗脱液，并定容至5 ml,混匀后过0.22 μm微孔滤膜，供高效液相色谱测定。

1.5 标准曲线的绘制

将配好的标准工作液，分别注入色谱仪，测定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6 灵敏度的测定

分别称取3份5.00 g空白配合饲料，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按10倍信噪比计算，求得该方法的定量限。

1.7 回收率的测定

称取5.00 g空白配合饲料，分别添加一定量的标准工作液，使得添加恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星的浓度为 1.0、2.0、4.0 mg/kg，达氟沙星为 0.2、0.4、0.8 mg/kg，每一浓度的样品设置5个重复，按样品处理方法测定，用外标法根据峰面积计算其含量和添加回收率。

2 结果与分析

空白饲料、阳性添加饲料、氟喹诺酮对照品溶液的液相色谱图见图1～图3。

图1 氟喹诺酮标准工作液的色谱

图2 空白试样中添加氟喹诺酮标准品的色谱

图3 空白试样中氟喹诺酮的色谱

2.1 标准曲线

将在选定的条件下，做定量校准曲线，以氟喹诺酮的浓度对峰面积绘制标准曲线，求回归方程和相关系数，结果见表1。

表1 HPLC标准曲线线性方程及回归系数

2.2 方法的检出限

该方法恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星在饲料中的检出限为1 mg/kg，达氟沙星为0.2 mg/kg。

2.3 准确度和精密度

添加浓度恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星为1.0、2.0、4.0 mg/kg，达氟沙星为 0.2、0.4、0.8 mg/kg 时，测得平均回收率为75%～105%，变异系数≤10%。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

根据相关报道，可以选用磷酸缓冲盐、乙酸乙腈、氨水乙腈、乙酸甲醇、氨水甲醇、氨水水溶液和乙酸水溶液进行饲料中添加氟喹诺酮药物的提取，试验发现用2%氨水水溶液提取效果最好。

3.2 固相萃取柱的选择

根据文献报道，采用C18、SCX、MAX固相萃取小柱进行回收率和净化效果比较，本方法选用MAX固相萃取小柱净化效果好，回收率能达到实验要求。

3.3 洗脱液的选择

分别选用水、氨水水溶液、甲醇溶液淋洗，发现甲醇能洗脱部分氟喹诺酮类药物，采用5%、10%、20%、50%、80%甲醇水溶液洗脱，用50%的甲醇水溶液效果最好，回收率高，能有效的除去部分极性杂质。

4 结论

恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星在饲料中添加浓度为1.0、2.0、4.0 mg/kg时，测得平均回收率范围分别为75.2%～103.2%，79.8%～103.9%，81.7%～104.3%，达氟沙星在饲料中添加浓度为0.2、0.4、0.8 mg/kg时平均回收率分别为79.6%～101.4%、78.6%～99.7%、85.4%～105.1%，变异系数范围为4.51%～8.82%，4.63%～8.85%，4.49%～9.83%，定量限为0.05 mg/kg。方法的稳定性强、重现性好，符合国家有关规定。

8篇，刊略，需者可函索）