端粒酶测定在肺癌诊断中的临床意义

冯海英 孙海波 韩云峰

1.齐齐哈尔医学院公共卫生学院，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省齐齐哈尔市第一医院骨外三科，黑龙江齐齐哈尔 161006

肿瘤细胞生长通常需要端粒酶的存在，其是目前发现的广谱肿瘤标志。有研究报道，多数肺癌细胞中均有端粒酶的激活。端粒酶是核糖核蛋白复合物，由蛋白质和RNA组成，具有逆转录酶活性[1-2]。肿瘤细胞区别于正常细胞主要为癌细胞永生化，研究表明，激活端粒酶基因与肿瘤细胞永生化存在密切关系[3]。关于多项联合检测肺癌患者端粒酶在肺癌中的临床意义，目前还没有报道。本研究分析了2009年1月～2010年12月期间我院收治的经确诊为肺癌合并胸水患者36例诱导痰、外周血、胸水、支气管冲洗液、纤维支气管镜活检组织的端粒酶活性，探讨端粒酶作为肺癌诊断标志物的临床价值，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年1月～2010年12月间我院收治的经确诊为肺癌合并胸水的患者36例的临床资料作为研究组，所有患者经纤维支气管镜检查，发现病变肺组织后钳取3～5块组织，离体后30 min内放入-80℃冰箱保存备用。标本进行病理学及组织细胞学检查，明确诊断为肺癌。36例患者中，男25 例，女 12 例；年龄 31～80 岁，平均（62.3±19.4）岁；主要临床表现：咳嗽28例，咯血26例，声音嘶哑10例，胸痛14例，发热21例，胸闷气短15例；病理分型：鳞癌19例（52.8%），小细胞癌4例（11.1%），腺癌10例（27.8%），未定型癌（腺鳞癌、复合性癌）3例（8.3%）。另选择35例同期经确诊肺部良性病变伴胸水患者作为对照组，其中，男24例，女11例；年龄 32～79 岁，平均（61.5±18.2）岁。两组年龄、性别等一般情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 Taq DNA聚合酶购自天象人生物工程公司，批号：02045674；AgNO3为北京化工厂产品，批号：111026；考马斯亮蓝G-250购自南京建成生物工程公司，批号：20110912；端粒酶检测试剂盒购自Onco Inc公司，批号：1104101。所有实验步骤均严格按药盒说明书操作。

1.2.2 诱导痰的采集 收集患者痰液3～5 mL放入无菌杯中，用无菌生理盐水洗涤两遍，加入等量的1 moL/L NaOH溶液，放入4℃冰箱24 h，取溶解痰液高速离心，将沉淀细胞放入-80℃冰箱备用。检测时，将冷冻的标本解冻后放入200μL的端粒酶裂解液中离心，移取上清液放入EP管中待测[4]。

表1 两组患者各指标端粒酶活性比较（x±s）

1.2.3 胸水细胞提取液的采集 各组患者胸腔穿刺术抽取新鲜胸水100 mL，高速离心，弃上清，离心细胞置液氮中保存（-196℃）。检测时，将冷冻的标本解冻后放入200μL的端粒酶裂解液中离心后移取上清液放入EP管中待测。

1.2.4 患者血细胞制备 抽取外周血5 mL，用肝素抗凝，血样经Ficoll分离液离心后，收集界面细胞，生理盐水洗涤1次，放入0.2 mL PBS中，将标本放在-20℃冰箱中保存[5]。

1.2.5 支气管灌洗液收集 气管镜顶端插入肺段或亚段支气管开口处，从活检孔用无菌生理盐水100 mL分5次注入，每次注入后立即在6.5～25.5 kPa的负压下吸出，回收液量40%～60%；双层纱布过滤后，离心放-80℃冰箱冻存[6]。

1.2.6 肺组织采集 采用电子纤维支气管镜活检患者时取肺组织，用PBS液冲洗后，液氮速冻放在-80℃保存。检测时取冰冻组织，剪碎，放入100μL细胞裂解液，水浴30 min，高速离心，收集上清液，放在-80℃冰箱中保存[7]。

1.2.7 TRAP-ELISA法测定端粒酶活性 取各种标本的细胞[（1×105）～（1×106）]加 150 μL 裂解液抽提端粒酶，离心后取上清2μL做反应模板；取TRAP反应管，各加入45μL反应混合物行端粒酶重复序列扩增 （TRAP），并与已处理的标本2 μL混匀，加入30μL液体石蜡，离心后置25℃水浴保存30 min，取出即行 PCR 循环扩增：94℃ 30 s，55℃ 30 s；共行 35个循环。结果判定：酶标仪波长450 nm/690 nm，端粒酶活性为△A=A450-A690。敏感性（阳性率）=测定指标的阳性例数/总例数。准确性=（真阳性数+真阴性数）/研究总例数。特异性=对照组测定指标的阴性例数/对照组的总例数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者各指标端粒酶活性的比较

研究表明，与对照组患者比较，研究组患者诱导痰性、外周血、胸水、支气管冲洗液、纤维支气管镜活检组织中端粒酶活性明显增高，两组患者比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。 见表 1。

2.2 多项指标端粒酶活性检测诊断肺癌的特异性、敏感性及准确性比较

5种标本联合检测的结果判断：5种标本检测均为阴性即判断为阴性，其中，有1种以上检测为阳性即判断为阳性。标本单独检测与联合检测敏感性、特异性和准确性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。五种标本中端粒酶活性联合及单独检测对肺癌的诊断敏感性、特异性和准确性情况见表2。

表2 多项指标端粒酶活性检测诊断肺癌的特异性、敏活性及准确性比较[%（n1/n2）]

3 讨论

端粒是染色体末端存在的独特重复片段特殊结构，在染色体定位、染色体保护、染色体复制控制细胞的生长方面起着控制的作用。当细胞发生分裂时，端粒片段出现缩短，促使细胞凋亡和导致程序性死亡[8]。端粒的长度又被称为是“有丝分裂钟”，而端粒酶作为一种逆转录酶可以用自身RNA为模板，在端粒DNA的3'末端，以逆转录方式延伸，修补细胞分裂时端粒的缩短，稳定端粒长度，导致细胞永生化，不断增殖和不死亡[9-10]，从而导致恶性变，所以端粒酶可以作为较广谱的肿瘤标志物。

本研究表明，与对照组患者比较，研究组患者诱导痰、外周血、胸水、支气管冲洗液、纤维支气管镜活检组织中端粒酶活性明显增高，两组患者相对应指标比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。在肺癌患者中，各类标本均显示端粒酶高表达，端粒酶逆转录酶基因的抑制，导致那些具有显著基因改变、脱离细胞周期、已失去端粒保护的细胞继续生长，因此，端粒酶活性检测可用于肺癌的诊断，是临床诊断手段的重要补充，有助于提高肺癌诊断的灵敏度及准确性[11]。本研究结果显示，联合5种标本中端粒酶活性的检测对肺癌的诊断敏感性、特异性和准确性与单独检测比较，差异有统计学意义（P＜0.05），联合检测诱导痰、胸水、外周血、支气管冲洗液、纤维支气管镜活检组织端粒酶活性对肺癌的诊断敏感性、特异性和准确性均较单项检测大大提高，特别是对肺癌伴胸水患者联合检测的早期诊断有重要意义。

综上所述，应用PCR方法检测端粒酶活性诊断肺癌敏感性高，特异性强，提高了诊断准确率。作为肿瘤标志物的端粒酶，在筛选肺癌高危人群、定期监测中可能具有重要临床指导意义。

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