PTEN/Akt/mTOR通路增加K562/ADM细胞化疗敏感性

成志勇，王素云，卞永生，温省初，杨 宁，高晓丽，韩 英，潘 崚

（1.保定市第一医院血液肿瘤科，河北保定 071000;2.河北省人民医院血液内科，河北石家庄 050051;3.华西医科大学华西医院血液内科，四川成都 610041）

PTEN/Akt/mTOR通路增加K562/ADM细胞化疗敏感性

成志勇1*，王素云2，卞永生1，温省初1，杨 宁1，高晓丽1，韩 英1，潘 崚3

（1.保定市第一医院血液肿瘤科，河北保定 071000;2.河北省人民医院血液内科，河北石家庄 050051;3.华西医科大学华西医院血液内科，四川成都 610041）

目的 探讨K562/ADM细胞系中PTEN/Akt/mTOR信号通路对不同化疗药物敏感性的影响。方法 K562/ADM细胞分为未转染组、转染野生型PTEN组（Ad-PTEN-GFP）、转染空载体组（Ad-GFP），并与不同浓度雷帕霉素或三氧化二砷（As2O3）联合作用。通过MTT法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光定量PCR检测PTEN、mTOR、BCL-2及BAXmRNA水平，Western blot检测 PTEN及 Akt、p-Akt蛋白水平。结果 野生型PTEN对K562/ADM细胞最大增殖抑制率为32.3%，与未转染组及Ad-GFP组相比，Ad-PTEN-GFP组mTORmRNA和p-Akt蛋白明显减低;雷帕霉素与As2O3联合应用后细胞增殖明显受抑，凋亡率（28.61% ±1.46%）明显高于单药作用组（P＜0.05），BCL-2mRNA表达降低，BAXmRNA表达增加，以联合干预组最为明显。结论 PTEN/Akt/mTOR信号传导通路能够增加K562/ADM细胞对雷帕霉素及As2O3的敏感性。

Akt;PTEN;mTOR;雷帕霉素;三氧化二砷

*通信作者（corresponding author）:dzczy@sohu.com

PI3K/Akt/mTOR通路是细胞内重要的信号传导通路，通过激活或抑制下游多种信号分子的表达，在细胞增殖、凋亡及多药耐药中发挥重要的生物学功能［1］。与张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因（PTEN）通过调控PI3K/Akt通路的去磷酸化发挥抑制肿瘤生长的功能。有研究表明，PTEN在包括造血系统肿瘤在内的多种肿瘤中表达降低，与肿瘤的不良预后密切相关［2－4］。

新近研究显示，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调控失常与白血病发病存在相关性［5－6］。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）是一种新型的大环内酯类免疫抑制剂，通过抑制mTOR发挥抗肿瘤增殖作用。三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）具有广泛的抗肿瘤作用，特别是对白血病细胞和肝癌细胞有明确的生长抑制作用。其作用机制可能与诱导细胞分化或促凋亡有关，但其分子生物学机制尚有待进一步研究［7－8］。

K562/ADM细胞是对包括阿霉素在内的多种化疗药物耐药的人白血病细胞系。本实验探讨野生型PTEN基因联合RAPA和或As2O3对K562/ADM细胞的增殖抑制作用及其可能的分子机制，为进一步的体内实验与临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及药物:反转录反应体系及引物（北京赛百盛生物工程公司）、SYBR Green Real Master Mix（北京天根生化科技有限公司）;PTEN、Akt、SER 473 p-Akt鼠抗人单克隆抗体（Santa Cruz公司）、HRP标记的山羊抗鼠IgG（北京鼎国生物公司）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物）;雷帕霉素（华北制药有限责任公司）、三氧化二砷（As2O3）（哈尔滨伊达药业有限公司）。

1.1.2 腺病毒及细胞系:重组腺病毒Ad-PTEN-GFP和Ad-GFP由上海吉凯生物公司合成并鉴定，在人胚肾细胞系293A细胞中进行扩增及滴度测定。293A细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，K562/ADM细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养;均在37℃含5%CO2饱和湿度环境培养。两种细胞均为本实验室长期保存品种。

1.2 方法

1.2.1 腺病毒转染和转染效率的测定:按感染复数（Multiplicity of infection，MOI）为200 在100 μL无血清培养液中加入含有PTEN基因（Ad-PTEN-GFP组;PTEN组）或空载体（Ad-GFP组;Ad组）的病毒液后转染K562/ADM细胞，在37℃、含5%CO2、无血清、无抗生素的1640培养基中孵育2 h后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养，48 h后流式细胞仪检测两组表达绿色荧光蛋白的细胞比例，计算转染效率及对细胞增殖抑制率的影响。

1.2.2 腺病毒转染及药物联合干预实验:RAPA用DMSO溶解，RPMI 1640培养基稀释成储存浓度，终浓度为20和50 nmol/L;4℃避光保存，As2O3用RPMI 1640培养基稀释，选用终浓度为2.5和5 μmol/L。

腺病毒Ad-PTEN-GFP或Ad-GFP转染K562/ADM细胞系后，即刻加入上述浓度的RAPA或As2O3观察0、24、48和72 h对细胞增殖、凋亡的影响。

将RAPA与As2O3联合应用，观察药物对细胞增殖、凋亡的影响，并与单药进行对比。

1.2.3 MTT实验:在96孔板中，每孔接种对数生长期K562/ADM细胞5 000个，每组设3个复孔，同时设立无细胞的空白对照，在干预后不同时间点，加入MTT溶液，培育4 h后离心弃上清，加入DMSO振荡数分钟，酶标仪读取吸光度A490值，计算细胞生长抑制率，绘制生长曲线。细胞生长抑制率=［对照组值－实验组］/对照组×100%。

1.2.4 凋亡率检测:1）碘化丙啶（PI）单标检测细胞凋亡率:收集转染不同时间的细胞，每组收集1×106个细胞，70%乙醇4℃固定过夜;加入RNA酶，37℃水浴消化15～30 min后加入PI，4℃存放15 min以上，流式细胞仪检测凋亡率。2）AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡率:收集不同干预组细胞，1×PBS洗涤2次后加入500 μL的连接缓冲液悬浮细胞，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，室温下避光、反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 实时荧光定量PCR:1）收集不同处理组细胞，Trizol提取总RNA，电泳鉴定RNA并定量，反转录合成cDNA。2）实时荧光定量PCR反应:SYBR反应体系共25 μL。反应条件为94℃ 5 min，94℃45 s，60℃ 1 min，30个循环，设空白对照。PCR反应前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为 Ct值。根据 ΔCt=Ct（目的基因）－Ct（β-actin），ΔΔCt=2－ΔCt计算检测基因 mRNA 相对表达量，每组重复3次取平均值。PCR引物序列（表1）。

表1 FQPCR扩增引物序列Table 1 Primer sequence of FQPCR

1.2.6 Western blot法检测靶蛋白表达水平:收集不同组 K562/ADM细胞，每组取107个细胞，加入200 μL预冷的蛋白裂解液，4℃裂解1 h，冰浴下超声裂解15 min。4℃ 18 000×g离心20 min，取上清用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，分装后置－20℃保存。取80 μg样品蛋白质加入等体积上样缓冲液，经5%浓缩胶和10%SDS-PAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，分别加入1∶500稀释的小鼠抗人PTEN、Akt和 p-Akt单克隆抗体，4℃培育过夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次。化学发光法检测后分析结果。

1.3 统计学分析

所有数据用SAS 8.0统计软件分析处理，计量资料进行t检验，F检验及q检验。

2 结果

2.1 过表达PTEN基因对K562/ADM的增殖抑制作用

当MOI为200时，流式细胞直接检测腺病毒感染K562/ADM细胞的效率为82.2% ±5.8%，符合基因治疗对载体的要求（图1）。

转染后第4～7天，各组K562/ADM细胞的增殖抑制出现显著差别，Ad-PTEN-GFP组细胞的最大生长抑制率（32.3%）出现在第5天，显著高于Ad-GFP组（P＜0.01）（图2）。

图1 以MOI=200转染3 d后细胞转染效率Fig 1 The transfection rate of K562/ADM cells after transfected with Ad-GFP or Ad-PTEN-GFP for the 3 days，with MOI=200

图2 PTEN对K562/ADM细胞的生长抑制曲线Fig 2 Anti-proliferation effect of PTEN on K562/ADM cells

2.2 野生型PTEN增加K562/ADM细胞对RAPA与As2O3的敏感性

干预后3 d，RAPA处理组:PTEN+RAPA 20及50 nmol/L组的A值均低于Ad+RAPA 20及50 nmol/L组（P＜0.01）;As2O3处理组:PTEN+As2O32.5及5 μmol/L组A值均低于 Ad+As2O32.5 及5 μmol/L组（P＜0.01）（图3）。

转染 3 d后，RAPA干预组:PTEN+RAPA 20 nmol/L组的凋亡率（29.1% ±3.7%）高于Ad+RAPA 20 nmol/L组（19.8% ±2.5%）（P＜0.05）;PTEN+RAPA 50 nmol/L组的凋亡率（34.9% ±3.5%）高于Ad+RAPA 50 nmol/L组（23.1% ±2.8%）（P＜0.01）;As2O3干预组:PTEN+As2O32.5 μmol/L组的凋亡率（50.6% ± 6.2%）高于 Ad+As2O32.5 μmol/L组（36.8% ±4.1%）（P＜0.01）;PTEN+As2O35 μmol/L组的凋亡率（69.2% ±5.2%）高于Ad+As2O35 μmol/L组（41.7% ±4.6%）（P＜0.01）。

2.3 RAPA和/As2O3对K562/ADM细胞增殖抑制的影响

不同组药物干预3 d后，RAPA 20 nmol/L+As2O32.5 μmol/L组的A值明显低于RAPA 20 nmol/L组及As2O32.5 μmol/L组（P＜ 0.01）;RAPA 50 nmol/L+As2O35 μmol/L组的A值明显低于RAPA 50 nmol/L组及As2O35 μmol/L组（P＜0.01）。不同浓度RAPA与不同浓度As2O3联合作用组A值均低于各药物单独干预组（P＜0.05）（图4）。

图3 不同浓度RAPA及As2O3对转染Ad-PTEN-GFP或Ad-GFP的K562/ADM细胞增殖抑制的影响Fig 3 The effect of different concentration rapamycin or arsenic trioxide treatment on the growth inhibition of K562/ADM cells transfected with Ad-PTEN-GFP or Ad-GFP

在RAPA及As2O3单药或联合应用24 h后，RAPA 20 nmol/L+As2O32.5 μmol/L 组 的 凋 亡 率（19.71% ±1.18%）明显高于 RAPA 20 nmol/L组（9.09% ±0.38%）或 As2O32.5 μmol/L组（14.79%±0.69%），（P＜0.01）;RAPA 50 nmol/L+As2O35 μmol/L组的凋亡率（28.61% ±1.46%）明显高于RAPA 50 nmol/L组（12.54% ±0.43%）或 As2O35 μmol/L组（20.21% ±1.29%）（P＜0.01）。

2.4 野生型PTEN、RAPA与As2O3对K562/ADM细胞中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路的影响

2.4.1 转染野生型PTEN基因降低p-Akt蛋白水平及mTORmRNA水平:转染 Ad-PTEN-GFP后，PTENmRNA（25.43±6.77）和蛋白表达水平明显高于Ad-GFP转染组（0.473±0.317）及未转染对照组（0.477±0.211）（P＜0.01）（图5）。

转染Ad-PTEN-GFP后，p-Akt表达水平明显下降，低于未转染组和Ad-GFP组（P＜0.01）。

同样，K562/ADM细胞转染PTEN基因后，mTORmRNA表达水平（0.219±0.042）明显低于未转染组（0.512±0.077）和 Ad-GFP组（0.501±0.071）（P＜0.01）。

2.4.2 RAPA对Akt、p-Akt及mTOR表达的影响:RAPA对Akt及p-Akt无明显抑制作用，但明显抑制mTORmRNA表达，未干预组、20 nmol/L和50 nmol/L RAPA组mTORmRNA表达水平分别为:0.512±0.077;0.248±0.067;0.152±0.054（P＜0.01），呈剂量依赖性减低。

2.4.3 As2O3对 Akt、p-Akt及 mTOR表达的影响:Akt无明显变化，p-Akt表达水平降低（图5），各组间P＜0.01，表明As2O3可以呈剂量依赖性抑制p-Akt表达。As2O3作用后mTOR有轻度减低，但无明显抑制作用。

2.5 野生型 PTEN基因、RAPA与 As2O3对K562/ADM细胞凋亡分子的影响

转染Ad-PTEN-GFP组BCL-2表达水平低于转染Ad-GFP组（P＜0.05），BAX表达水平则高于Ad-GFP组（P＜0.05）。Ad-PTEN-GFP与 RAPA或As2O3联合作用组BCL-2表达低于Ad-GFP联合RAPA或As2O3作用组（P＜0.05），BAX表达水平与BCL-2表达水平相反。

RAPA与As2O3联合作用组BCL-2mRNA表达水平低于单独作用组，BAXmRNA表达水平则高于单独作用组（P＜0.05）（表2）。

表2 PTEN基因、RAPA、As2O3及联合作用组于K562/ADM 细胞3 d后BCL-2、BAX mRNA表达水平的影响Table 2 The BCL-2，BAX mRNA expression levels in K562/ADM cells transfected with Ad-PTENGFP or Ad-GFP together with rapamycin or arsenic trioxide，or treated with rapamycin and/or arsenic trioxide for 3 days

3 讨论

PI3K/Akt通路是细胞内重要的信号传导通路，通过激活下游 mTOR、NF-κB，进一步促进 BCL-2、BCL-xL表达，抑制P53、灭活caspase、诱导细胞周期基因转录或其转录调控子的生成等，在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、诱导肿瘤细胞多药耐药等方面发挥重要作用［1］，包括白血病在内的多种肿瘤中存在此信号通路的功能异常。

研究显示PI3K抑制剂可以抑制白血病细胞增殖，同时增加其对依托泊苷、阿糖胞苷和As2O3等传统化疗药物的敏感性［8－9］。

PTEN通过其磷酸酶活性调控PI3K/Akt通路去磷酸化，发挥肿瘤抑制功能［1－3］，研究发现，PTEN基因在白血病中突变罕见，但有不同程度缺失、低表达及甲基化。将野生型PTEN转染急性髓系白血病（AML）耐药细胞系HL60AR和急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞系 EU-1后，分别增加了细胞对As2O3［8］及阿霉素［10］的敏感性。PTEN 去甲基化后可逆转Ph+ALL细胞对伊马替尼的耐药［11］。

本研究结论与上述研究一致，通过将野生型PTEN转染K552/ADM细胞后，可以增加该细胞对RAPA或As2O3的敏感性。RAPA为mTOR抑制剂，PTEN基因可以直接或间接抑制mTOR表达，RAPA与野生型 PTEN联合作用后，可抑制 PI3K/Akt/mTOR通路，发挥协同抗肿瘤作用。As2O3自身具有抑制p-Akt的活性，与PTEN基因转染联合作用于K562/ADM细胞后，通过抑制p-Akt活性，增加了细胞对As2O3的敏感性。

根据本研究结果推测，RAPA抑制mTOR表达、As2O3抑制p-Akt表达，两药合用增强了对PI3K/Akt/mTOR通路抑制作用，从而发挥协同抗肿瘤效果。

本研究还发现转染PTEN基因或RAPA与As2O3单药处理K562/ADM细胞后均可以单独抑制BCL-2，增加BAXmRNA的表达，在联合作用后，抑制BCL-2及增加BAXmRNA表达的作用明显增强，从而提示上述方法联合应用后可以增加相互之间的协同作用。

本研究通过将野生性PTEN基因转染K562/ADM细胞，证实了野生型PTEN基因可以增加K562/ADM细胞对RAPA或As2O3药物的敏感性，同时RAPA与As2O3联合应用增强了对K562/ADM细胞的增殖抑制作用，通过探讨上述协同作用的可能的分子机制，为逆转白血病多药耐药提供理论依据。

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PTEN/Akt/mTOR pathway enhances drug sensitivity in K562/ADM cells

CHENG Zhi-yong1*，WANG Su-yun2，BIAN Yong-sheng1，WEN Xing-chu1，YANG Ning1，GAO Xiao-li1，HAN Ying1，PAN Ling3

（1.Dept.Hematology and Oncology，the First Hospital of Baoding，Baoding 071000;2.Dept.Hematology，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050000;3.West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

ObjectiveTo investigate the influence of PTEN/Akt/mTOR pathway in drug sensitivity of K562/ADM cells.MethodsK562/ADM cells were divided into untrsfected group，transfected with PTEN group（Ad-PTENGFP），transfected with empty vector group（Ad-GFP）.Each group was treated with rapamycin and or arsenic trioxide at different concentrations.The inhibited rate of K562/ADM cells from each group was measured by MTT assay;the apoptosis rate was assessed by flow cytometry（FCM）.The mRNA expression ofPTEN，mTOR，BCL-2andBAXwere detected by real-time fluorescent relative-quantification reverse transcriptional PCR（FQ-PCR）.PTEN，Akt and p-Akt protein levels were detected by western blotting.ResultsThe maximum growth inhibition rate was 32.3%after transfected withPTENgene.Compared with Ad-GFP group，after transfacted with Ad-PTENGFP into K562/ADM cells，p-Akt protein andmTORmRNA expression levels were down-regulated.RAPAmycin and arsenic trioxide had synergistic effect on growth inhibition of K562/ADM cells and the inhibition rate（28.61±1.46%）was higher than that in cells with single drug treatment（P＜0.05）.BCL-2mRNA was down-regulated butBAXmRNA up-regulated，especially in combination groups.ConclusionsPTEN/Akt/mTOR pathway can enhance the anti-leukemia effect of rapamycin and arsenic trioxide in K562/ADM cells.

Akt;PTEN;mTOR;RAPAmycin;arsenic-trioxide

R 733

A

1001-6325（2012）01-0049-07

2010－12－29

2011－06－15

保定市科技攻关计划（11ZF003）