腺相关病毒在心脏基因转导中的应用※

刘海燕 袁 洪*

1 刘海燕，硕士研究生，中南大学药学院，湖南长沙 410013 2 *袁洪，通讯作者，教授，中南大学湘雅三医院临床药理中心，湖南长沙 410013

目前常用的基因转导的病毒载体主要有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。研究表明，腺病毒具有高效的转染率，可有效地感染心肌细胞，但其本身具有免疫源性，且不能使目的基因长期表达，不适合于心脏疾病的基因治疗[1]。慢病毒和腺相关病毒均可使目的基因在靶细胞内长期、稳定的表达，且免疫源性低，是心脏基因转导的优选载体。然而，慢病毒虽可有效地感染体外心肌细胞，但其体内的心肌基因转染率不及腺相关病毒[2]。本文主要概述了腺相关病毒在心脏基因转导中的应用。

1 腺相关病毒概述

腺相关病毒（Adeno Associated Virus，AAV）是一类无包膜的单链线性 DNA病毒，外包衣壳蛋白。可分为三个功能区：开放阅读框 rep、开放阅读框cap及两端145bp长的ITR序列。rep蛋白在病毒整合、复制、包装中起着重要作用；cap蛋白是包装成完整病毒所需的衣壳蛋白；ITR是复制的起始区，是复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件，在将病毒基因整合至宿主染色体上起着关键的作用，AAV偏向于将目的基因整合至人基因组19号染色体q臂的特定位置上[3]。AAV载体中目的基因后端为增强子，前端为强启动子，通常为CMV启动子。在构建病毒载体的过程中，可以通过选择合适的启动子，如心肌特异性启动子 cTnT等加强构建病毒载体的心肌靶向性。

AAV宿主范围广，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞（如：神经元、肌细胞、造血干细胞等）也较敏感；本身无直接细胞毒性或免疫原性；可使目的基因长期表达。但AAV病毒容量小（＜5kb），基因转染率低，在一定程度上限制了其在临床上的应用。

2 腺相关病毒在心脏基因转导中的应用

AAV存在多种血清型，不同的血清型因其衣壳蛋白的序列与空间构象不同，具有不同的组织或细胞的侵蚀性。Zincarell等通过小鼠尾静脉注射AAV1-9血清型病毒，分析9种血清型在体内的靶向性（见表 1）。结果表明，4、6、7、8、9型均可高效地感染心肌组织，感染后的心肌组织荧光强度排序如下：9型＞6型＞8型＞4型＞7型。然而，虽然感染后9型的心肌组织荧光强度高于6型，但9型除在心肌组织表达外，在全身其他多处部位也检测有很强的荧光表达，对心肌的靶向性不如 6型。因此，较之于AAV9、AAV6更适合心肌基因转染[4,5]。为了提高AAV对心肌的靶向性，人们利用心肌特异性启动子对AAV进行改造，促使目的基因特异性地在心肌表达。AAV9在体内的第一高表达部位是肝，其次是心肌组织（见表1），Prasad等构建了含cTnT启动子的 AAV9病毒，结果表明，目的基因在心肌组织的表达水平是体内第二大高表达部位肝的 640倍，cTnT启动子可有效地引导目的基因在心肌的特异性表达[6]。

表1 尾静脉注射AAV1-9后体内各组织部位荧光强度

研究表明，AAV可使目的基因在心肌组织长期、稳定的表达。通过小鼠尾静脉注射AAV1-9血清型病毒后，检测目的基因表达水平发现，9种血清型均可使目的基因在体内长期、稳定的表达，以7、9型的目的基因体内表达水平最高，其次为1、6、8型，2、3、4、5型表达量最低[4]。对新生4～5天的乳鼠心包注射2.5×1011拷贝数的AAV1、6、7、8、9血清型病毒，6周后检测体内目的基因表达水平，结果显示，该剂量下的所有血清型均可高效地将目的基因导入心肌组织，且在肝组织中几乎检测不到目的基因表达，所有血清型中以AAV9表达水平最高。持续观察AAV9在心肌组织中的表达发现，注射1周后目的基因可达稳定，2周后达到高峰，后一直持续至6周，1年后仍可在心肌组织中检测到一定的表达水平[7]。

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