狭叶柴胡内生真菌分布特征的研究1）

高宁，王强，王振月，程玉鹏，3＊

（1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300192；3.哈尔滨师范大学，哈尔滨 150024）

柴胡为伞形科植物柴胡（BupleurumchinenseDC.）或 狭 叶 柴 胡 （BupleurumscorzonerifoliumWilld.）的干燥根，是我国传统的重要中药材［1］。柴胡中含有皂苷、甾醇、黄酮、挥发油、多糖等成分，主要药效成分为柴胡皂苷，其中柴胡皂苷a，d具有明显的药理活性。柴胡的药理作用广泛，具有镇静、解热、抗炎、抗病毒、保肝利胆、抗肿瘤及调节免疫系统活性等作用，极具开发与研究前景［2－3］。但近几年，由于对柴胡野生药用资源的盲目、过度采挖，致使柴胡的药用资源日益减少，已不能满足市场的需要。内生真菌（endophytic fungi）是一类普遍存在于健康植物体内的，不引起宿主病变的共生菌。研究表明，某些内生真菌能够产生与宿主相同或相似的化学成分，特别是近年来，相继发现了能够产紫杉醇、长春花碱等有效成分的内生真菌，使得药用植物内生真菌这一研究领域受到了广泛的关注［4］。由于柴胡资源日益紧张，因此，对柴胡开展内生真菌研究，明确柴胡内生真菌分布特征，将有助于进一步开发能够产生有效成分的柴胡内生真菌、筛选并减少对野生柴胡的依赖，降低经济与生态成本。

1 材料与方法

1.1 材料

原植物采自黑龙江中医药大学药用植物园，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为狭叶柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）。

试剂：马铃薯葡萄糖培养基（PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000m L，琼脂15g。121℃高压蒸汽灭菌30min），乳酸－棉兰染液，升汞，医用酒精等。

仪器：电热手提式压力蒸汽消毒器（哈尔滨市松花江医疗器械厂）、Ⅱ级B2型生物安全柜（北京哈尔东联仪器制造有限公司）、PH－71电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、奥林巴斯CX31显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 柴胡内生真菌的分离

取新鲜健康的狭叶柴胡植株，用洗洁剂清洗材料表面，蒸馏水冲洗干净，除去泥土大颗粒及表面浮灰。表面消毒：无菌条件下将实验材料放入75%乙醇中浸泡45s，无菌水冲洗4～5次（每次2min），随后放入0.1%升汞溶液中浸泡3min，无菌水冲洗4～5次（每次2min）。用无菌刀片将根切成5mm×5mm×5mm的小块，将茎切成5mm的小段，将叶切成5mm×5mm的小片。将切好的材料放入PDA培养基中，每个平皿中放置4～5块，并尽量将切面贴于培养基。置于28℃恒温培养箱中，倒置，暗培养5～10天，每日定时观察材料，待材料切口处长出菌丝后，及时地挑取前端的菌丝，将其转接至新的PDA培养基中培养，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化柴胡内生真菌。将纯化的菌种编号，转入PDA斜面，置于4℃冰箱中保存［5］。

1.2.2 狭叶柴胡内生真菌的鉴定

采用点植法观察柴胡内生真菌的菌落形态，利用插片法观察柴胡内生真菌显微结构特征，参照文献［6－7］进行柴胡内生真菌的鉴定。

2 结果与分析

2.1 狭叶柴胡内生真菌鉴定结果

从狭叶柴胡中共分离得到13株内生真菌，其中根中分离得到7株，叶中分离的到2株，茎中分离得到4株。经形态学观察与显微鉴定，除一株毛霉属真菌为接合菌亚门外，其余分属于半知菌类的2目、3科、6属。狭叶柴胡内生真菌各属具体分布见表1。

表1 狭叶柴胡内生真菌的分布特征

2.2 柴胡内生真菌分布特征

已鉴定的13株柴胡内生真菌分属于7个不同的属，于柴胡的根、茎、叶中都可分离到内生真菌，表明狭叶柴胡内生真菌具有一定的多样性且内生真菌在狭叶柴胡各组织均有分布。但各组织中所分离得到的内生真菌数量差距较大，其中根中分离得到7株，明显高于茎（4株）与叶（2株）中分离的内生真菌数量。所分离出的内生真菌以半知菌为主，分离出的内生真菌中，并没有优势单一的菌群，且未见某一种属在根、茎、叶均能够有分布。特别是曲霉属、毛霉属仅在根中分离得到，而镰刀孢属真菌仅在茎中分离得到，表明狭叶柴胡内生真菌的分布具有一定的组织专一性。

3 结论与讨论

以往研究结果显示，不同植物中分离得到的内生真菌数量与种类均存在差异［8］，本研究共从狭叶柴胡中分离得到13株内生真菌，分属于7个不同属，且各属真菌分布并不均一，表明狭叶柴胡内生真菌具有一定的生物多样性，且分布具有一定的组织专一性。

研究过程中发现，狭叶柴胡组织块表面消毒的方法直接影响内生真菌的分离效果，研究之初，本项目组采用已有的表面消毒方法，然而效果并不理想，由于各植物表面结构及组织本身特点存在差异，使得表面消毒剂的种类及消毒时间需酌情而定，一些方法虽然能够适用于几种植物与组织，但尚未有一种能够普遍适用的表面消毒程序，因此，在开始分离某一植物内生真菌时，要对所用消毒剂的种类、联合使用的组合方式及消毒时间等进行系统的考察，使其能够在不伤及内生真菌的前提下杀灭植物表面真菌。

内生真菌分离过程中另一个重要问题是内生细菌的影响。植物内生菌大体可分为内生真菌与内生细菌，与内生真菌相似，内生细菌同样广泛的存在于各种属植物中，且其生长迅速，一般1～2天即可从组织切面处长出，影响了后续内生真菌的分离与纯化。因此，本实验在真菌纯化过程中向培养基中添加一定浓度的抗生素从而抑制内生细菌的生长，排除干扰。另外，在内生真菌分离过程中，要注意每日观察，及时挑取从切面处长出的内生真菌，同时要挑取菌丝生长的最前端部分，特别是同一切面同时长出2种以上内生真菌时，要注意防止交叉污染。

由于内生真菌能够产生与宿主相同或相似的有效成分，且真菌具有易培养、易控制、生产成本低、生长快等特点，使得这一研究领域受到科学工作者的广泛关注，本研究对柴胡内生真菌进行了分离并探讨了柴胡内生真菌的分布特征，有关能够产生有效成分的狭叶柴胡内生真菌的筛选与开发利用将在进一步的研究工作中开展。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.一部.2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：263.

［2］吴明芳.中药柴胡中的有效成分及其药理作用的研究进展［J］.中华中西医学杂志，2010，8（6）：32－34.

［3］张阳，李敏，柳林，等.柴胡生长发育规律的分析［J］.中国林副特产，2010（5）：45－46.

［4］胡凤，程玉鹏，王振月，等.药用植物内生真菌研究现状及其应用前景［J］.生物技术通讯，2008，19（5）：781－783.

［5］程玉鹏，王振月，李慧玲，等.盘龙参内生真菌分布特征的研究［J］.中国林副特产，2008（2）：22－23.

［6］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

［7］H.L.巴尼特，B.B.亨特.沈崇尧，译.半知菌属图解［M］.北京：科学出版社，1977.

［8］姜怡，杨颖，陈华红，等.植物内生菌资源［J］.微生物学通报，2005，32（6）：146－147.