异养小球藻主要营养成分及氨基酸组成分析

董黎明，汪 苹，李金穗，孙 阳

(北京工商大学 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048)

异养小球藻主要营养成分及氨基酸组成分析

董黎明，汪 苹，李金穗，孙 阳

(北京工商大学 食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048)

测定来自不同产地的4株蛋白核小球藻和2株椭圆小球藻异养培养后的主要营养成分和氨基酸组成，对其营养进行评价，并利用聚类和主成分分析探讨异养小球藻在营养成分和氨基酸含量上的差异。结果显示：异养小球藻主要营养成分均低于文献报导的自养小球藻，4株异养蛋白核小球藻和2株椭圆小球藻必需氨基酸占氨基酸总量的比例分别为34.94%～37.45%和37.70%～38.32%，必需氨基酸指数分别为37.50～49.52和131.89～135.77。影响异养蛋白核小球藻营养品质的限制性氨基酸为色氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。聚类分析将4株异养蛋白核小球藻和2株异养椭圆小球藻各归为一类。主成分分析提取出两个主成分因子，主成分1和主成分2的贡献率分别为76.23%和17.80%，累积贡献率达94.03%。

异养小球藻；营养成分；氨基酸；聚类分析；主成分分析

小球藻(Chlorella)属绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲、小球藻属，是一种普生性单细胞绿藻。我国常见的种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻和普通小球藻等。小球藻是一种高蛋白、高多糖、低脂肪、富含多种维生素及矿物质的单细胞藻类，具有多种营养保健功能[1-4]。其分布广，生物量大，生长繁殖速度快，不仅能利用光能自养，还能进行异养高密度培养。异养培养可不受光照和温度的影响，单位体积收获量可达自养藻的10倍[1]，这为工业化大规模生产及其广泛应用提供了可能[5-8]。

目前国内外在小球藻的分子生物学[9]、生长因子的提取及其生理效应[10-12]、油脂提取及生物柴油制备[13-16]、培养方式与条件优化[17]及其在食品、医药和环境中的应用[18]都已经开展了大量研究。小球藻中营养成分的分析是众多研究的基础，魏文志等[19]运用聚类和主成分分析对7种不同自养小球藻氨基酸组成及含量进行了差异性分析，而目前对不同种异养小球藻主要营养成分和氨基酸组成差异的研究鲜有报道。本实验以6株异养培养来自不同产地的蛋白核小球藻和椭圆小球藻为研究对象，通过分析其主要营养成分及氨基酸组成，运用聚类分析和主成分分析方法，结合文献报导的自养小球藻营养组成及含量，进行综合比较分析，旨在为异养小球藻的营养评价、分类及应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

6株异养小球藻的名称、来源和产地见表1。其中CE2 实验室分离自北京玉渊潭公园八一湖，经DNA提取、PCR扩增产物测序后经同源性分析后确定。

表1 小球藻的名称、来源与产地Table 1 Names, providers and origination of 6 types of Chlorella sp.

1.2 仪器与设备

QHZ-12B型组合式恒温振荡培养箱 江苏太仓实验仪器厂；ALPHA 1-2 LD型真空冷冻干燥机 德国Christ公司； KjeltecTM2100凯式定氮仪 丹麦FOSS公司；L-8900氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 小球藻的异养培养

小球藻采用BG11液体培养基，其配制方法为：

Stock1： 取柠檬酸0.3g、柠檬酸铁铵0.3g、Na2-EDTA 0.05g，定容至100 mL；Stock2： 取KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O 3.75g，定容至1000mL；Stock3：取CaCl2·2H2O 1.8g，定容至100mL；Stock4： H3BO32.86g、MnCl2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·5H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g，定容至1000mL。配制1L BG11液体培养基需Stock1 2mL、Stock2 20mL、Stock3 2mL、Stock4 1mL，初始培养基KNO31.5g/L、葡萄糖40g/L。

实验在装液量为100mL的250mL三角烧瓶中进行。接种量为 10%，培养温度为 25℃，起始 pH值为7.0，摇床转速为120r/min，黑暗条件下培养。根据实验室前期藻种异养培养生产曲线，确定达到对数生长期(第5天)时取样，8000r/min离心10min，除去上清液，用蒸馏水洗涤藻细胞，重复离心、洗涤3次，真空冷冻干燥后研磨得藻粉，ˉ18℃密封冷冻保存备用。

1.3.2 小球藻主要营养成分的测定

小球藻细胞水分含量分析采用常压烘箱干燥法[20]，80℃恒温烘至质量恒定；灰分及有机质含量分析采用灼烧法[21]；粗蛋白含量分析采用凯式定氮法[22]；叶绿素测定采用丙酮提取比色法[23]；水解氨基酸、游离氨基酸测定采用分光光度法[24]。

粗脂含量测定采用超声波提取法[25-26]：称取0.1g藻粉置于离心管中，加2mL正己烷-异丙醇(1:1，V/V)溶液，摇匀后放入超声仪中连续超声萃取25min，保持温度在(30±1)℃；萃取后于10000r/min离心10min，移取上层清液于质量为m1的离心管中，重复上述实验两次，105℃烘箱烘干2h，称质量为m2，则粗脂质量为m=m2ˉm1。各营养成分含量均以干质量计。

1.3.3 氨基酸含量的测定

氨基酸组成及含量分析委托北京市营养源研究所分析检测中心测定。样品处理采用色氨酸以4.2mol NaOH水解，以过甲酸氧化法处理测定胱氨酸，其余氨基酸以6mol HCl水解测定，检验方法为GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》。氨基酸含量以干质量计。

1.3.4 营养品质评价

根据FAO/WHO1973年建议的氨基酸评分标准模式(%，dry)[27]和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式(%，dry)[28]分别计算氨基酸分[3]和必需氨基酸指数(EAAI)[29]。

式中：A、B、C…I为小球藻必需氨基酸含量/%；AE、BE、CE…IE为全鸡蛋蛋白质的必需氨基酸含量/%。

1.4 数据处理

使用SPSS13.0软件进行数据处理，对6株异养小球藻的主要营养成分进行聚类分析，对氨基酸组成及含量进行聚类和主成分分析。

1.4.1 聚类分析

采用等级聚类分析，对6株异养小球藻主要营养成分、氨基酸种类及含量分别进行样品聚类，用树形图显示其亲疏程度与相似性。

1.4.2 主成分分析

采用因子分析中的主成分分析，从18种氨基酸种类变量中提取2个综合性指标(主成分1和主成分2)，并得到主成分负荷因子及其贡献率，利用提取的主成分因子作样品分布图。

2 结果与分析

2.1 异养小球藻粉的主要营养成分含量

表2 异养小球藻主要营养成分含量Table 2 Contents of main nutritional components in heterotrophic Chlorella sp.g/100g

由表2可以看出，4株异养蛋白核小球藻(CP1、CP2、CP3、CP4)的粗蛋白、总叶绿素和水解氨基酸含量均高于2株异养椭圆小球藻(CE1、CE2)，其平均值分别是椭圆小球藻的2.1倍、3.7倍和2.2倍。CP2的粗蛋白和总叶绿素含量最高，分别为36.25g/100g和122.20g/100g，CP3的水解氨基酸含量最高为30.85g/100g。这可能是由于蛋白核小球藻更适合于异养培养，也是目前研究中报道最多的异养培养藻种[3,17]。2株椭圆小球藻的粗油脂平均含量则是蛋白核小球藻的1.7倍，CE1粗油脂含量最高达60.2g/100g，说明异养椭圆小球藻在油脂利用方面有更加广阔的研究和应用前景。

在同种小球藻的主要营养成分对比上，4株蛋白核小球藻的粗蛋白、游离氨基酸和水解氨基酸的含量差异不大，而在总叶绿素和粗脂含量上差异较大。CP2的总叶绿素含量(122.20g/100g)是CP4的(35.64g/100g)3.4倍，CP1的粗脂含量(41.90g/100g)是CP2(23.6g/100g)的1.8倍。CE1的粗脂、粗蛋白和水解氨基酸含量均明显高于CE2，但总叶绿素和游离氨基酸的含量仅为CE2的近1/3和1/2。这种同种异养小球藻主要营养成分的差异说明不同产地的小球藻对异养培养的适应存在差异性。

与文献报道的自养小球藻营养成分进行对比，异养蛋白核小球藻的粗蛋白平均含量仅为文献值(53.79g/100g)[19]的63%，总叶绿素平均含量仅为文献值(28.61mg/g)[17]的32%；异养椭圆小球藻的粗蛋白平均含量仅为文献值(43.81g/100g)[19]的37%，导致这种差异的原因在于异养(无光照)生长小球藻的代谢方式和途径与自养生长(有光照)相比发生了很大的改变[17]。说明异养培养降低了小球藻的营养成分含量，但是由于异养培养大大提高了小球藻的产量[1]，因此小球藻异养培养的综合效益依然显著。

2.2 异养小球藻氨基酸的组成及含量

表3 异养小球藻氨基酸组成及含量Table 3 Amino acid composition of heterotrophic Chlorella sp. g/100g

蛋白质中所含必需氨基酸的种类、数量和构成比例决定了其营养价值。由表3可见，6株异养小球藻中均含有18种氨基酸，并包括人体所需的8种必需氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和丙氨酸的含量较高，蛋氨酸、组氨酸、胱氨酸的含量较低，色氨酸的最低，仅为0.03～0.17g/100g，且各氨基酸含量的高低顺序基本一致。异养椭圆小球藻中必需氨基酸占氨基酸总量(EAA/TAA，E/T)(37.70%～38.32%)和必需氨基酸与非必需氨基酸比值(EAA/NEAA，E/N)(60.50%～62.12%)均大于异养蛋白核小球藻的E/T和E/N比，但两者均接近世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)提出的蛋白质中EAA/TAA应达到40%、EAA/NEAA应大于60%的参考模式。

在同种小球藻的氨基酸含量比较上，CP1的大多数氨基酸含量、EAA和TAA均低于其他3株异养蛋白核小球藻，CE1的主要氨基酸含量、EAA和TAA则大于CE2。从蛋白质的营养价值来看，CP3和CE2的EAA/TAA和EAA/NEAA的比值均高于其他同类小球藻，更接近于FAO/WHO的参考蛋白模式值。

表4 异养小球藻必需氨基酸组成评价(FAO/WHO建议模式)Table 4 Evaluation of EAA composition of heterotrophic Chlorella sp. with FAO/WHO mode

与文献报道的自养小球藻氨基酸组成及含量进行对比，异养小球藻除蛋氨酸、精氨酸和胱氨酸外，其他15种氨基酸的含量均远远低于自养小球藻。异养蛋白核小球藻的EAA和TAA则几乎是自养蛋白核小球藻的一半，异养椭圆小球藻的EAA和TAA是自养椭圆小球藻的3/4。这与异养小球藻主要营养成分的分析对比一致，说明异养培养降低了小球藻的营养物质含量。同时，异养小球藻的EAA/TAA和EAA/NEAA比只是略低于自养小球藻，说明营养物质含量的降低并未显著改变小球藻的营养价值。

2.3 必需氨基酸组成评价

通过计算异养小球藻必需氨基酸占粗蛋白质的含量，与FAO/WHO的建议蛋白模式和全鸡蛋蛋白模式进行比较，得出6株异养小球藻的氨基酸分和必需氨基酸指数，见表4、5。

表5 异养小球藻必需氨基酸组成评价(全鸡蛋模式)Table 5 Evaluation of EAA composition of heterotrophic Chlorella sp. with Eggs mode

由表4、5两种模式的氨基酸组成评价可以看出，异养蛋白核小球藻的必需氨基酸组成几乎均低于相应的FAO/WHO建议模式和全鸡蛋模式的参考值。Trp的含量偏低最大，为第一限制性氨基酸，CP1、CP2和CP3的Thr的含量仅为建议模式的一半多，为第二限制性氨基酸，CP4的Ile为第二限制性氨基酸。若不考虑第一限制性氨基酸分，第二性氨基酸分和EAAI指数均为标准参考模式的一半左右，应该属于植物蛋白质这一等级。与文献报导的自养蛋白核小球藻的EAAI指数值57.69[19]相比也是偏低，再次证明了异养培养降低了蛋白核小球藻的营养品质，这与主要营养成分和氨基酸含量的结论一致。

然而，异养椭圆小球藻的必需氨基酸组成几乎均远高于相应的FAO/WHO建议模式和全鸡蛋模式的参考值，仅Trp的含量接近或低于标准值，是CE2的限制性氨基酸。CE1的氨基酸分和EAAI指数、CE2的第二氨基酸分和EAAI指数均高于标准参考模式，也明显高于文献报导的自养椭圆小球藻的EAAI指数值65.39[19]，说明异养培养的椭圆小球藻氨基酸组成品质更高。

2.4 聚类分析

对6株异养小球藻主要营养成分和氨基酸含量分别进行聚类分析，得到小球藻营养成分和氨基酸含量聚类图(图1、2)。结果显示，无论在小球藻主要营养成分还是氨基酸含量上，4株蛋白核小球藻可聚为一类，2株椭圆小球藻可聚为一类，说明异养蛋白核小球藻与椭圆小球藻差异显著。在4株异养蛋白核小球藻之间，CP1、CP2和CP3在营养成分和氨基酸含量上更为接近，与CP4的差异显著。在2株椭圆小球藻之间，CE1和 CE2在氨基酸含量的差异要明显大于主要营养成分的差异，说明异养培养时不同产地和来源的椭圆小球藻对其氨基酸品质影响要大于蛋白核小球藻。

图1 异养小球藻主要营养成分聚类分析树形图Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram for main nutritional components of heterotrophic Chlorella sp.

图2 异养小球藻氨基酸组成聚类分析树形图Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram for amino acid of heterotrophic Chlorella sp.

2.5 主成分分析

对6株异养蛋白核小球藻氨基酸组成进行主成分分析得主成分负荷因子及其贡献率如表6所示。主成分1(PC1)的贡献率为76.23%，主成分2(PC2)的贡献率为17.80%，两个因子的累积贡献率即达94.03%，说明用两个因子即可概括6株异养小球藻之间的差异。按照主成分的负荷因子，主成分1主要包括了Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val和Leu等氨基酸信息，主成分2主要包括Arg和Cys等负荷因子。与文献[19]提取的3因子相比，本研究主成分分析提取的2个因子即可概括异养蛋白核小球藻和椭圆小球藻在氨基酸组成上的差异，在主成分因子所代表的氨基酸信息上，主成分1均包含了Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、Val和Leu等氨基酸信息，但在主成分2上差异显著。

表6 主成分负荷因子及其贡献率Table 6 Loading factors and contribution rates of two principal components from heterotrophic Chlorella sp.

将提取的PC1和PC2作6株异养小球藻氨基酸组成分布图(图3)。可以看出，4株异养蛋白核小球藻中CP2和CP3最为接近，CP1较为接近，CP4在PC2轴上距离较远，这和聚类分析中图2的结果一致。而2株异养椭圆小球藻CE1和 CE2则主要在PC2轴上差异显著。椭圆小球藻和异养蛋白核小球藻在PC1和PC2轴方向均差异显著。

图3 主成分因子表达的异养小球藻氨基酸组成分布Fig.3 Distribution of amino acid for heterotrophic Chlorella sp. with extracted principle component factors

3 讨 论

异养培养小球藻由于生长繁殖比自养培养快得多，一直备受研究者关注，一些异养培养的蛋白核小球藻最高生物量是自养培养的近50倍[17]。然而，异养培养却显著降低了小球藻的营养物质含量，本实验中异养蛋白核小球藻与椭圆小球藻在粗蛋白、叶绿素和氨基酸含量上均明显小于文献报导的自养蛋白核与椭圆小球藻。导致这种差异的原因一方面在于异养(无光照)生长小球藻的代谢方式和途径与自养生长(有光照)相比发生了很大的改变[17]，另一方面异养培养的营养盐、C/N、接种量及温度、pH值等培养条件也会对小球藻中蛋白质等营养物质的含量产生影响[23]。本实验中相同培养条件下4株异养蛋白核小球藻在粗蛋白、水解氨基酸及总必需氨基酸含量上的较小差异，可能是不同产地藻种的自身蛋白质含量差异的原因。

蛋白质的营养价值体现在氨基酸组成及含量，尤其是8种人体必需氨基酸的组成及含量。尽管异养培养降低了蛋白核和椭圆小球藻必需氨基酸和总氨基酸含量，但在必需氨基酸组成及营养品质上，异养蛋白核和椭圆小球藻仍接近于FAO/WHO提出的蛋白质中EAA/TAA应达到40%、EAA/NEAA应大于60%的参考模式[27]，说明异养培养的小球藻仍具有较高的营养价值。

氨基酸分和必需氨基酸指数(EAAI)用于评价蛋白质的质量，两者越接近100说明其与标准蛋白的必需氨基酸组成越接近，营养价值越高[3,29]。本研究中异养椭圆小球藻的氨基酸营养品质要优于异养蛋白核小球藻，其EAAI指数均优于全鸡蛋蛋白模式。

聚类分析可将不同藻株进行初步分类，根据其差异大小，分析藻株间的差异程度。本实验结果表明，4株异养蛋白核小球藻和2株异养椭圆小球藻差异显著，说明不同藻种间在营养成分和氨基酸含量上差异明显，这首先应该是二者自身遗传物质的差异决定的。3株异养蛋白核小球藻CP1、CP2和CP3在营养成分和氨基酸含量上更为接近，而2株椭圆小球藻CE1和 CE2在氨基酸含量的差异要明显大于主要营养成分的差异。这种引起同种间营养成分差异的原因还有待深入研究。

主成分分析是将18种氨基酸通过线性变换以提取几个重要因子的一种多元统计分析方法，根据所提取因子所代表的含义可以更轻易表达藻株在氨基酸含量上的差异。本研究将18种氨基酸综合为两个主成分因子，累积贡献率达94.03%。根据所提取因子的散点图可以判别藻株在各轴的分布及差异，进而说明各因子所代表的氨基酸含量差异，这比聚类分析提供的信息更加详细，也可作为类似研究的分析指标，主成分分析方法使不同小球藻氨基酸差异分析更为简单。但小球藻在异养和自养培养条件下营养成分含量和品质差异的内在机理还有待进一步深入研究。

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Analysis of Nutritional Components and Amino Acid Composition of Heterotrophic Chlorella sp.

DONG Li-ming，WANG Ping，LI Jin-sui，SUN Yang
(Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Four strains of Chlorella pyrenoidosa and 2 strains of Chlorella ellipsoidea under heterotrophic culture were analyzed for nutritional components and amino acid composition. Cluster analysis and principle component analysis were conducted to distinguish the differences among the heterotrophic strains of Chlorella sp.. The results showed that the contents of main nutritional components of the heterotrophic strains of Chlorella sp. were lower than previously reported results for autotrophic Chlorella sp.. The ratios of essential to total amino acids of the strains of Chlorella pyrenoidosa and Chlorella ellipsoidea were 34.94%ˉ 37.45% and 37.70%ˉ38.32%, and the essential amino acid indexes 37.50ˉ49.52 and 131.89ˉ135.77, respectively. The limiting amino acids affecting the nutritional quality of 4 strains of Chlorella pyrenoidosa were Trp, Thr and Ile. The results of cluster analysis indicated that 4 strains of Chlorella pyrenoidosa and 2 strains of Chlorella ellipsoidea could be assigned to two different clusters according to the contents of nutritional components and amino acids. Two principal components were extracted to reveal a contribution rate of 76.23% for the first principle component and 17.80% for the second principle component. The cumulative contribution rate of the principal components was up to 94.03%.

heterotrophic Chlorella sp；nutritional components；amino acid；cluster analysis； principal component analysis

Q517

A

1002-6630(2012)03-0232-06

2011-10-25

环境保护部环保公益性项目(200909029)

董黎明(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为环境微生物。E-mail：donglm@btbu.edu.cn