香菇发酵葛根生产总黄酮的工艺研究

刘金哲，史小青，姚艳飞，王 莘*

(吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118)

香菇发酵葛根生产总黄酮的工艺研究

刘金哲，史小青，姚艳飞，王 莘*

(吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118)

目的：研究香菇发酵葛根对总黄酮得率的影响。方法：通过单因素及正交试验进行培养基筛选及发酵条件优化。结果：总黄酮得率较高的培养基配方(g/100mL)为：玉米粉2、蛋白胨0.2、磷酸二氢钾0.5、硫酸镁0.2；总黄酮得率最佳发酵条件：香菇菌种子液接种量5%、葛根添加量8g/100mL、温度35℃、pH 7、转速150r/min、发酵时间144h。结论：在上述条件下，香菇发酵葛根后总黄酮含量达到2.727mg/g，与对照组(不接香菇)比较含量提高了120.81%。

葛根；香菇；总黄酮；共发酵

葛根(Radiχ Puerariae lobatae)为豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)ohwi)的干燥根[1]，是常用的传统中药，属于我国卫生部公布的药食两用资源，富含淀粉和黄酮类化合物。现代药理研究表明，葛根总黄酮及单体葛根素是葛根的主要有效成分，具有维护心脑血管健康、降血脂、抗癌、抗衰老、增强机体免疫力等多种生理功能[2-6]。微生物发酵中药是中药研究的新方向和新内容[7-8]，其具有提高已知成分含量[9-10]，提高中药药效[11-12]，为中药活性成分结构修饰[13]，降低毒副作用[14]等优势，从而为保健食品和药品工业提供更有价值、更实用的生产原料。

香菇(Lentinus edodes)具有生长繁殖力强，易于培养等优点，并在液体发酵过程中产生丰富的酶系，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等，具有对木质纤维素、木质素、果胶等物质的分解利用能力[15-16]，有利于促进葛根中有效成分的释放。本实验对香菇发酵葛根产黄酮工艺进行探索，为提高葛根总黄酮得率提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香菇菌种由吉林农业大学生命科学学院生物工程实验室保存；葛根由吉林省长春市宏检药店购买，已制成饮片。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L)：马铃薯200、葡萄糖20、琼脂20、磷酸二氢钾3、硫酸镁1.5，pH值自然，121℃灭菌20min；种子液培养基(g/L)：马铃薯200、葡萄糖20、磷酸二氢钾3、硫酸镁1.5，pH值自然，121℃灭菌20min；基础液体发酵培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、磷酸二氢钾3、硫酸镁1.5，葛根添加量5g/100mL，pH值自然；115℃灭菌15min。

1.3 方法

1.3.1 香菇菌种子培养

斜面菌种活化2～3次后，在无菌条件下接至装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中密闭摇床培养，转速150r/min、培养温度28℃、培养时间48h。

1.3.2 基础发酵

按5%接种量将香菇菌种子液接至基础液体发酵培养基中密闭摇床培养，转速150r/min、培养温度28℃、培养时间288h(即12d)。确定香菇发酵葛根产总黄酮的最佳时间时，设不接种香菇为对照组。

1.3.3 葛根总黄酮的超声辅助提取[17]及发酵液测定前处理[18-19]

将发酵一定时间的发酵混合物在70℃超声提取30min，重复提取2次后，取一定量的发酵液，10000r/min离心10min除菌体，取上清液，用等体积无水乙醚萃取3次脱脂，脱色素，精密吸取水层0.5mL测定总黄酮含量。

1.3.4 总黄酮含量测定

标准曲线的制作及总黄酮含量测定根据于村等[20]所述方法进行，得出回归方程为：y＝0.107χ＋0.022，R2＝0.998。

1.3.5 培养基筛选实验

1.3.5.1 培养基碳源筛选

基础液体发酵培养基碳源分别替换为等量的玉米粉、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖，接种香菇菌种144h后，分别取不同碳源的发酵处理组进行总黄酮含量的测定。

1.3.5.2 培养基氮源筛选

基础液体发酵培养基氮源分别替换为等量的蛋白胨、酵母粉、硝酸铵、尿素、硝酸钾，接种香菇菌种144h后，分别取不同氮源的发酵处理组进行总黄酮含量的测定。

1.3.5.3 培养基筛选正交试验[21-22]

在单因素试验基础上，进行正交试验。以总黄酮含量为指标，选择可溶性淀粉质量浓度、蛋白胨质量浓度、磷酸二氢钾质量浓度、硫酸镁质量浓度4个因素，设3个水平进行正交试验，因素水平设计见表1。

表1 液体发酵培养基筛选正交试验因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of culture medium ingredients for orthogonal array design

1.3.6 发酵条件优化的正交试验

在基础液体发酵培养基筛选试验基础上，进行发酵条件优化试验。以总黄酮含量为指标，选择种子液添加量、葛根添加量、温度、初始pH值4个因素[23]，每个因素设3个水平进行正交试验。

表2 发酵条件优化正交试验因素水平表Table 2 Coded values and corresponding actual values of fermentation conditions for orthogonal array design

1.3.7 数据统计处理

实验所得数据采用Statistical Product and Service Solutions数据统计分析软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 香菇发酵葛根最佳时间的确定

图1 不同发酵时间总黄酮含量比较Fig.1 Effect of fermentation time on the extraction efficiency of total flavonoids

由图1可知，对照组(不接种香菇)自振荡处理144h开始，总黄酮含量由0.888mg/g开始逐渐增高，一直保持增长趋势但是增幅较小，含量最高为1.235mg/g。香菇发酵葛根最佳时间144h总黄酮含量达最大值2.161mg/g。

2.2 培养基筛选单因素试验结果

2.2.1 培养基添加碳源的比较结果

表3 不同碳源对香菇发酵葛根后总黄酮含量的影响Table 3 Effect of carbon source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

由表3可知，香菇发酵葛根培养基中添加不同碳源对香菇发酵葛根产总黄酮的产量不存在显著性差异(P＞0.05)。从节约生产成本考虑，选用玉米粉为发酵培养基碳源。

2.2.2 香菇发酵葛根培养基添加氮源的比较结果

由表4可知，培养基中以玉米粉为碳源，添加蛋白胨为氮源有利于显著提高香菇发酵葛根后总黄酮含量(P＜0.05)。

表4 不同氮源对香菇发酵葛根后总黄酮含量的影响Table 4 Effect of nitrogen source on the content of general flavonoids in Radiχ puerariae after fermentation

2.2.3 基础液体发酵培养基筛选正交试验结果与分析

表5 基础液体发酵培养基筛选L9(34)正交试验结果及分析Table 5 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing culture medium ingredients

从表5的R值可以看出，不同营养成分对香菇发酵葛根的影响次序为A＞C＞D＞B，最佳配方为A1B1C3D2，即：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氢钾0.5g/100mL、硫酸镁0.2g/100mL。采用最佳培养基配方进行验证实验，发酵后葛根总黄酮含量可达2.603mg/g。

2.3 发酵条件优化的正交试验结果与分析

表6 发酵条件优化L9(34)正交试验结果及分析Table 6 L9(34)orthogonal array design and results for optimizing fermentation conditions

从表6的R值可以看出，不同发酵条件对香菇发酵葛根的影响次序为C＞D＞A＞B，温度为最主要影响因素；最佳发酵条件为A1B2C3D2，即：香菇菌种子液添加量5%、葛根添加量8g/100mL、培养温度35℃、初始pH值7。采用最佳培养基及最优发酵条件做验证实验，总黄酮含量可达2.727mg/g。

3 结 论

3.1 通过比较不同发酵时间的葛根经香菇发酵后总黄酮含量，发现接种香菇菌种后144h为香菇发酵葛根提高总黄酮含量的最佳发酵时间。发酵时间超过144h时总黄酮含量逐渐减少，与香菇的胞外酶(纤维素酶、果胶酶、淀粉酶)活性随发酵时间变化的规律有较大相关性[24]。3.2对香菇发酵葛根这一复杂的发酵代谢过程而言，采用不同的考察指标，优化发酵条件的实验结果可能是不同的，本实验主要是研究有利于提高总黄酮含量的工艺，因此研究获得的最佳培养基与发酵条件仅是在此指标下的优化结果，而针对其他代谢产物，需要进一步研究。最佳培养基配方为：玉米粉2g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氢钾0.5g/100mL、硫酸镁0.2g/100mL。最佳发酵条件：香菇菌种子液接种量5%、葛根添加量8g/100mL、培养温度35℃，初始pH值7。

3.3 最佳碳氮比的培养基，适宜纤维素酶解的温度等对提高黄酮含量起积极作用[16]，本实验采用优化后的培养基及发酵条件后，总黄酮含量达2.727mg/g，与不接种香菇对照组相比提高了120.81%。

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Optimization of Lentinus edodes Fermentation before Extraction of Total Flavnoids from Radiχ Puerariae

LIU Jin-zhe，SHI Xiao-qing，YAO Yan-fei，WANG Xin*
(School of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To determine the effect of Lentinus edodes fermentation on the extraction efficiency of total flavonoids from Radiχ Puerariae and optimize culture medium ingredients and fermentation conditions. Methods: The optimization of medium ingredients and fermentation conditions was carried out using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Results: The optimal medium composition (g/100 mL) consisted of corn meal 2, peptone 0.2, monopotassium phosphate 0.5, and magnesium sulfate 0.2, and the optimal fermentation conditions were inoculum amount of 5%, Radiχ Puerariae concentration of 8 g/100 mL, fermentation temperature of 35℃, fermentation pH of 7, rotation speed of 150 r/min, and fermentation time of 144 h. Conclusions: Under these conditions, the content of total flavonoids was 2.727 mg/g, which revealed a 120.81% increase compared with the control group (without the inoculation of Lentinus edodes).

Radiχ Puerariae；Lentinus edodes；total flavonoids；fermentation

Q815

A

1002-6630(2012)03-0212-03

2011-01-16

刘金哲(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵与功能产品开发。E-mail：307754310@qq.com

*通信作者：王莘(1959—)，女，教授，硕士，研究方向为微生物发酵与功能产品开发。E-mail：wangxin5853@126.com