兰溪余粮山柿子软腐病的发病机制研究

申屠旭萍，俞晓平，董胜张，马 正，蒋芝云，吴晓峰，范金根

（1.中国计量学院 生命科学学院，浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，浙江 杭州 310018；2.兰溪市森林病虫防治检疫站，浙江 兰溪 321100）

柿树在我国已有2000多年的栽培史.柿子含1%以上可溶性糖，其含胡萝卜素、维生素C及钙、磷、铁等矿物质胜过苹果、梨、桃、李等果品，还具有止血润便、降血压、生津润肺治咽喉痛等医疗保健的功效［1－4］.浙江兰溪的大红柿闻名省内外，曾多次获得省、市级优质农产品金奖.目前兰溪市的柿子种植面积达1135公顷，已成为当地农民的主要经济来源之一.随着柿树在兰溪市种植面积的不断扩大和集约化程度的提高，柿树病虫害种类不断增加，导致柿子产量损失严重，质量明显下降，给果农造成了重大的经济损失［5－9］.2006年以来，又有一种新病害在兰溪暴发成灾，该病害主要发生在果实采摘期，导致柿子部分变软变腐，丧失商品性.2007年当地因这种病害造成5%以上的果实不能正常进入市场，损失惨重.仅兰溪市黄店镇余粮山一个村就损失柿子果产量40吨以上，给广大柿农造成了重大的经济损失.

明确导致柿果软腐病的发病机理，提出合理的病害控制技术对减少因该病害引起的经济损失和增加果农的收入非常必要，同时对促进兰溪市乃至全国的柿果产业可持续发展意义重大.该病害是病原性病害、生理性病害或者是由环境污染因素引起的？本研究开展了病原微生物分离、高效合理的防治措施筛选和环境污染因子对病害发生的影响研究等工作，为明确柿果软腐病害的发生机制奠定基础.

1 材 料

1.1 试验地点

兰溪市黄店镇余粮山柿子种植区.

1.2 病原菌培养基

1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1L；

2）PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1L；

3）高氏一号合成培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1L；

4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，琼脂20g，水1L［10］；

5）柿子汁诱导培养基：在上述培养基中分别添加新鲜柿子汁组成不同配方培养基，添加量为1ml／10ml.

1.3 供试杀菌剂

丙森锌70%可湿性粉剂（拜耳作物科学有限公司生产），687.5g／L氟菌·霜霉威悬浮剂（商品名：68.75%银法利悬浮剂，拜耳作物科学有限公司生产），722g／L霜霉威盐酸盐（商品名：普力克水剂，拜耳作物科学有限公司生产），400g／L嘧霉胺（商品名：施加乐悬浮剂，拜耳作物科学有限公司生产），430g／L戊唑醇（商品名：好力克悬浮剂，拜耳作物科学有限公司生产），甲基硫菌灵70%可湿性粉剂（江苏龙灯化学有限公司生产），硫酸链霉素72%可湿性粉剂（石家庄通泰生化有限公司生产），溴硝醇20%可湿性粉剂（辽宁丹东市农药总厂生产）和噻菌铜20%悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司生产）.

2 试验方法

2.1 病原组织微生物的分离与镜检

2.1.1 病果表面消毒 75%酒精消毒5min→无菌水冲洗→10%次氯酸钠消毒5min→无菌水冲洗.

2.1.2 病菌固体培养基平板分离 去柿子皮，用无菌刀切取病原组织4～5mm大小的块状移至固体平板培养.同时，另切取同样大小组织小块置于无菌水中，充分捣碎，将菌悬液稀释成10－1，10－2，10－3三个梯度，分别涂布.将含牛肉膏蛋白胨培养基的平板置于37℃培养箱中培养1～2d.将含PDA培养基、高氏一号合成培养基和马丁氏培养基的平板置于28℃培养箱中培养3～5d.

2.1.3 病菌液体培养基诱导培养 去柿子皮，用无菌刀切取组织4～5mm小块移至含有柿子汁的液体诱导培养基中培养.

2.1.4 用无菌接种环挑取柿子汁涂片，干燥，固定，用草酸铵结晶紫溶液染色，镜检.

2.2 杀菌剂的防治试验

采用东方红3WB－15X背负式机动喷雾机和延伸喷头直接对柿子树喷施不同的杀菌剂，喷施要求药液雾滴分布均匀，覆盖率高，药液湿润叶面和果面不产生流失为宜.共设9种杀菌剂，每种药剂设3个地点处理，每个处理设3次重复，稀释农药的清水作为阴性对照.施药时间为采摘前期（7月～9月间），共计喷雾3次.柿子采摘期检查防治效果.

2.3 SO2处理对柿子的影响

采用2.5L密闭的微波炉专用盒子（直径9.6cm、高8.8cm），每个盒子中放置大小均一成熟度较一致的柿子10个，在盒子中放置一个敞口且加有不同量的Na2SO3和稀H2SO4溶液的小玻璃瓶1只，然后密闭盒子.利用复分解反应Na2SO3＋H2SO4＝Na2SO4＋SO2↑＋H2O产生SO2气体.密闭容器中SO2含量分别为2.38mg、0.59mg、0.15mg、0.04mg、9.30×10－3mg、2.33×10－3mg、5.81×10－4mg、1.45 ×10－4mg、3.63×10－5mg、9.08×10－6mg、2.27×10－6mg共11个处理，对照组只有柿子不加SO2，每日观察盒子内柿子的变化.

2.4 数据处理

试验数据分析在SPSS15.0统计软件下处理.

3 结果与分析

3.1 病原微生物对柿子软腐病的影响

对2010年9月27日、10月8日和10月17日采摘回的3批次病果分别进行病原菌分离试验.结果表明：用不同的培养基和固体及液体培养后，平板上未见有细菌、放线菌和真菌菌落生长，液体培养基也未变浑浊或见丝状微生物生长.进一步对柿子汁涂片染色后观察，在显微镜下未见微生物细胞，具体结果，见图1.

图1 柿子病原组织微生物的分离培养结果Figure 1 Isolation and culture of pathogenic microorganism in Diospyros kaki tissue

3.2 杀菌剂对软腐病的防治

在2010年7—9月间，分别选择前两年软腐病较严重的3个种植区域进行防治试验.喷施后柿子成熟时每个试验区域每个处理分别采摘30个左右果子进行软腐病统计，分析农药对软腐病的防治效果，见表1.

试验结果表明，在3个区域利用9种杀菌剂处理后柿子的病果率和对照无显著性差异，这也间接表明供试杀菌剂对该病害没有明显的防治效果.

表1 九种杀菌剂对柿子软腐病的防治效果Table 1 Control efficacy of nine kinds of fungicides against soft－blet disease of Diospyros kaki

3.3 正常果子和病果形态观察

刚从树上采摘下来的病果症状为顶部颜色比其他部位显红，且较软（图2）.在常温放置数天后，柿子其他部分也逐渐变红，原来顶部先变红的部分变干，颜色上和其他部位已无差别.掰开后肉眼观察未见有病原菌菌落生长，也无腐烂现象.把正常柿子另挑出，放置数天后发现顶部也变干变褶皱，只是颜色比病果稍浅（图3）.

图2 病果Figure 2 Diseased Diospyros kaki stored for several days

图3 放置数天后正常果子与病果外观比较Figure 3 Appearance of non－diseased and deseased fruit

3.4 SO2对柿子的影响

尽管实验室密闭模拟试验和种植区环境有一定的差异，但10d后观察到SO2处理的盒子中出现柿子先变红现象，腐熟度比对照明显高.其中密闭容器中SO2含量为2.38mg，0.59mg，0.15mg，0.04mg，也就是质量浓度分别为9.52×10－1mg／L，2.36×10－1mg／L，6.00×10－2mg／L，1.6×10－2mg／L的腐熟现象明显（图4），这初步说明SO2气体可以刺激柿子早熟变软.

图4 SO2对柿子软腐的影响Figure 4 Influence of SO2on Diospyros kaki soft－blet

4 讨 论

针对2006年以来在兰溪余粮山柿子种植区新出现的病害——柿子软腐病，本研究分别从病果病原菌分离鉴定、不同杀菌剂的防治试验、不同环境因子的监测和对病害发生的影响等3方面入手开展了该病发生的机制初探.选择了适合细菌、放线菌和真菌培养的培养基，补充了加入柿子汁的诱导培养基，结果均未分离到病原菌.防治试验中选用了针对真菌性病害和细菌性病害的杀菌剂，并且采用了不同的防治浓度，但未见有防效.从形态上观察病果和正常果子不同主要在于颜色，未见有腐烂现象.结合上述结果可以初步判断该病害不是由病原菌引起的，也即非病理性病害.

实地调查中发现，当地柿农施用的农药和化肥每年种类基本相同，病害状况也不同于植物缺素或者药害.柿农反映发病区域每年都不尽相同.余粮山柿子软腐病大量发生前其周边建造了发电厂，是否发电厂排放的气体诱发了该病害的发生有待于进一步的监测和研究？但实验室研究表明，柿子接触SO2气体后出现成熟和腐软的现象.《兰州市大气污染对儿童肺功能的影响研究》课题研究也表明，植物接触SO2、O3等大气污染物以后，体内会产生应激乙烯.

2011年在试验的3个区域分别随机采摘50个柿子进行病害统计，结果均未发病.同时，我们委托兰溪市环境保护监测站在余粮山柿子种植区设点进行为期一周的空气中二氧化硫、氮氧化物监测，采样方法为连续24h采样，监测结果是环境空气中二氧化硫、氮氧化物浓度符合GB3095—1996《环境空气质量标准》二级标准.这是否进一步说明该病害的发生和当地环境条件以及气候相关，如温度、风向，等等，这些因素均可导致柿子树种植区SO2浓度的高低.

由于柿子软腐病是新出现的一种病害，同时研究时间受到柿子生长周期的限制，这两方面的因素给本研究带来了一定的困难.但经过两年的研究分析，可以初步明确该病既非病理性病害也非生理性病害，有可能与环境因素相关.

［1］周 坚，万楚筠，沈汪洋，等.甜柿的营养及功能特性［J］.武汉工业学院学报，2004，23（4）：15－17.

［2］刘月英.磨盘柿的生物技术研究［D］.保定：河北农业大学，2004.

［3］BADENES M L.Genetic diversity of persimmon accessions introduced and surveyed in Spain［J］.Options Mediterraneennes，2002，12（4）：71－73.

［4］胡婉珊，郭琳博，李宇华，等.柿子加工中关键技术的研究进展［J］.食品科学，2010，31（13）：342－346.

［5］王 峰.柿树病害防治技术［J］.河北果树，2010（3）：24.

［6］杨玉萍，刘力思，杨华俊，等.柿树病害防治技术［J］.植物医生，2005，18（3）：23.

［7］唐志祥，蒋芝云，陈金明，等.金华市柿园病虫害调查及综合治理研究［J］.中国植保导刊，2007，27（4）：29－30.

［8］蒋志云，唐志祥，邵生富，等.碎斑簇天牛生物学特性初报［J］.中国森林病虫，2004，23（5）：26－27.

［9］徐志宏，蒋芝云，蒋惠中，等.柿伪安瘿蚊生物学特性及其防治研究［J］.林业科学研究，2000，13（1）：57－62.

［10］沈 萍，陈向东.微生物学实验（第四版）［M］.北京：高等教育出版社，2007：241－242.