Aes对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

李明星 袁丹丹 陈亮 李黎博 陈柳 李荣惠庞晓辉 夏洪伟 冷卫兵 唐秋琳 毕锋

四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，

信号转导及分子靶向治疗研究室，△腹部肿瘤科，四川 成都 610041

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其复发转移是影响预后的主要因素［1］，因此研究与肝癌细胞侵袭、转移的相关分子机制是该领域的一大热点。Aes(amino-terminal enhancer of split，Aes)是转录因子Groucho/TLE家族成员，能与转录因子结合调控转录，但不具有DNA结合位点［2］。近期的研究表明Aes能够通过抑制notch信号通路抑制结肠癌的转移，且Aes的表达缺失能够促进结肠癌的血行转移［3-4］，提示Aes在肿瘤转移中扮演着重要角色。为进一步探讨Aes在肝癌转移中的作用，我们检测了Aes在不同肝癌细胞系中的表达情况，通过构建Aes表达载体，转染其低表达的肝癌细胞系HepG2，观察其对肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系

人肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721为本实验室保存。

1.1.2 试剂

细胞培养基RPMI-1640、小牛血清，转染试剂LipofectamineTM2000、Opti-MEM均购自美国Invitrogen公司，兔抗人Aes多克隆抗体购自美国Sigma公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司，CCK-8试剂盒购自日本Dojindo公司，RT-PCR试剂盒购自TaKaRa，质粒pEGFP-N1为本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建和细胞转染及实验分组

通过Primer Premier 5.0设计Aes(NM_001130)的引物，上游引物HindⅢ5’-CCCAAGCTTCCGCGATTGACATGAT-3’、下游引物KpnⅠ 5’-GGGGTACCGTATCCGACTTC TCGCCAT-3’，以cDNA为模板扩增Aes片段，双酶切目的片段，将其连到pEGFP-N1的HindⅢ和KpnⅠ位点，通过酶切鉴定以及测序验证。依照说明书，通过LipofectamineTM2000分别将pEGFP-N1和pEGFP-Aes转入肝癌细胞系HepG2，实验分pEGFP-N1(对照组)和pEGFPAes(实验组)。

1.2.2 RT-PCR检查Aes mRNA的表达

设计A e s上下游引物，上游引物：5’-CACCAGGAGGATGATGGCGAG-3’，下游引物：5’-GGCGTGGAGGTGTCTGGAACTA-3’，扩增产物为560 bp。以GADPH为内参，其上游引物序列为5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT G-3’，下游引物序列为5’-AGGGGCCAT CCACAGTCTTC-3’。TRIzol试剂提取待测细胞的总RNA，取一定量的RNA逆转录获得cDNA后，进行半定量PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测不同细胞系中Aes的表达及外源Aes的表达

收集对数期生长的待测细胞及转染48 h之后的细胞，RIPA裂解液重悬细胞并反复吹打，超声破碎后，4 ℃，134 00×g，离心15 min。取上清液作为细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取一定量的蛋白样品40 μg，进行12%SDSPAGE；260 mA湿转90 min至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃温育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗避光温育，摇床2 h，Odyssey红外激发扫描成像系统扫描成像结果。

1.2.4 荧光显微镜观察蛋白定位

转染pEGFP-N1和pEGFP-Aes的细胞在Nikon荧光显微镜蓝光激发下，绿色荧光蛋白发绿光。

1.2.5 细胞增殖能力检测实验

将细胞以每孔1×103接种于96孔板中，LipofectamineTM2000转染，每天每组取3孔，每孔避光加10 μL CCK-8，37 ℃温箱温育2～4 h，Micro-ELISA仪读取光密度，选择490 nm波长，测定各孔吸光值(A)，连续5 d，记录结果，以时间为横坐标，A490nm值为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力

以每孔2×105个细胞接种对数生长期细胞于6孔板中，第2天分别用LipofectamineTM2000转染pEGFP-N1和pEGFP-Aes，用移液枪头分别在培养板底部呈一字形划痕，每天观察并拍照，镜下记录划痕区细胞的迁移情况，软件分析划痕区的相对距离，并计算其相对迁移率：(第0天记录的相对距离-第3天记录的相对距离)/第0天记录的相对距离×100%。实验重复3次。

1.2.7 Transwell小室检测细胞侵袭能力

将BD hanging cell culture inserts置入24孔板中，将BD Matrigel Basement Membrance Matrix 按1∶3的比例用无血清培养基稀释，取35 μL铺入小室底层，37 ℃放置2 h使其凝固；收集转染48 h的细胞，用无血清培养基重悬，将1×104个细胞250 μL加入小室，下层培养板中加入700 μL含小牛血清20%的RPMI-1640培养基。培养48 h后用棉签拭去小室上层细胞，HE染色，显微镜下观察侵袭的细胞数目，分15个视野对细胞进行计数。实验重复3次。

1.3 统计学处理

实验数据通过SPSS 18.0统计学软件分析，用表示，样本间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Aes在不同肝癌细胞系中的表达情况

通过RT-PCR和Western blot检测肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的mRNA和蛋白表达(图1)，发现相对于SMMC-7721，Aes在HepG2中的表达明显降低。因此，我们在随后的试验中选择HepG2作为研究对象，观察了Aes对HepG2恶性生物学行为的影响。

2.2 pEGFP-Aes重组蛋白表达载体构建、酶切鉴定

将构建好的pEGFP-Aes分别经HindⅢ和KpnⅠ酶切后电泳，可见593 bp(Aes编码区片段大小)的片段(图2)。

2.3 pEGFP-Aes在HepG2细胞中的表达鉴定

通过Western blot检测转入的pEGFP-Aes的表达，在荧光显微镜下观察Aes在细胞中的定位，发现Aes在细胞核和细胞质中都有表达，并且能在细胞核中形成点状浓积(图3)。

2.4 Aes对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响

2.4.1 Aes对肝癌细胞HepG2增殖的影响

将pEGFP-N1、pEGFP-Aes分别转染HepG2细胞后，CCK-8检测细胞增殖活性，发现与pEGFP-N1组相比，pEGFP-Aes对肝癌细胞HepG2的增殖并无显著影响(图4)。

2.4.2 Aes抑制肝癌细胞HepG2的侵袭能力

同pEGFP-N1组相比，转染了pEGFP-Aes的肝癌细胞HepG2发生侵袭的细胞数目明显减少，差异有统计学意义(P<0.05，图5，表1)。

2.4.3 Aes抑制肝癌细胞HepG2的迁移能力

pEGFP-N1组划痕区明显变窄，而pEGFPAes组肿瘤细胞划痕间距离基本没有变化，迁移率明显降低(P<0.05，图6，表1)，说明Aes能够明显抑制肝癌细胞迁移。

表 1 pEGFP-Aes对HepG2侵袭迁移能力的影响Tab.1 The effect of pEGFP-Aes on the invasion and migration of transfected HepG2 cells

3 讨 论

Groucho/TLE家族主要是通过与转录因子结合来调控下游基因的表达，Aes是该家族的重要成员之一，但其本身并不具有DNA结合位点，在成骨、神经及眼的发育过程中起重要作用［5-7］。早期的研究表明，Aes能够通过调节TCF/LEF-1的活性来激活Wnt信号通路，从而进一步参与调控发育［8］。

目前，关于Aes的报道较少，其在肿瘤发生、发展和转移过程中所起的作用尚不明确。有研究发现，在细胞质中，Aes能与线粒体蛋白Bit1结合诱导线粒体途径的细胞凋亡［9］，近期的研究表明，Aes在结肠癌转移中扮演重要角色，Aes的表达缺失可能是导致结肠癌发生转移的重要因素，但Aes不参与调控结直肠肿瘤的生长［4］。

Aes是否在肝癌转移中也起着至关重要的作用目前尚不清楚。本研究首先检测了不同肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中Aes的表达水平，发现无论是mRNA水平还是蛋白水平，Aes在HepG2中都比较低，由此我们构建pEGFPAes表达载体，在HepG2细胞中Aes过表达，结果发现Aes能够在细胞核中形成点状浓积。根据文献报道，Aes在细胞核内可以募集转录因子，形成难溶的转录抑制复合物，抑制下游基因的转录［3］。我们在荧光显微镜下看到的点状浓积可能是Aes与其他转录因子相互结合抑制基因转录的复合物，但Aes结合的是哪些转录因子，是否在行使其抑制转录因子的功能还有待进一步研究。此外，转入Aes能够明显抑制肝癌细胞HepG2的侵袭和迁移，在一定程度上逆转肿瘤的恶性生物学行为。以往研究证明，Aes能够抑制结肠癌细胞中Notch信号通路，而Notch信号通路与肿瘤的侵袭和迁移有很大联系，例如Notch通路中的配体Notch1表达下调将会抑制NF-κB的活性，进而抑制VEGF和MMP-9的表达［10-11］，但此种推断尚需要进一步的实验 证实。总之，研究Aes在抑制肝癌细胞的侵袭和迁移方面所起的重要作用，能够为肝癌的治疗和预后提供一个新的靶点。

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