IGF-1R抑制剂AG1024对头颈鳞癌FaDu细胞放射敏感性的影响

俞立萍 李萍 章青 徐文才 李兆斌 傅深

头颈鳞癌是世界第6大恶性肿瘤，在我国年发病率可达15.22/10万，排在恶性肿瘤发病的第7位。早期的头颈鳞癌对单一的手术或者放疗效果较好。然而，超过一半的头颈部鳞癌患者首次就诊时就已经处于晚期阶段，故5年生存率低于50%。以铂类为基础的化疗药物作为放疗增敏剂能提高治愈率，却会导致更严重的并发症和死亡率。所以，寻找一种新的靶向头颈鳞癌的治疗方法至关重要。胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)是酪氨酸蛋白激酶家族的成员，在各种类型细胞上均有表达，与多种肿瘤的发生、发展、增生、侵袭、转移和凋亡密切相关，在头颈鳞癌中高表达［1-3］。

本研究拟设计体外实验，研究IGF-1R抑制剂AG1024在体内外对人咽鳞癌FaDu细胞的放射增敏作用，并分析其产生放射增敏的可能机制.

1 材料和方法

1.1 主要药物和试剂

MEM细胞培养液和胎牛血清购自Hyclone公司，AGl024购自德国Calbiochem公司，AnnexinⅤ-FITC/PI购自Invitrogen公司，γ-H2AX抗体购自Millipore公司。蛋白质印迹法(Western blot)及免疫沉淀所用抗体购自cell signaling 公司, protein-A/G beads购自碧云天公司。

1.2 FaDu细胞的培养

头颈鳞癌FaDu细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，在含10%胎牛血清的MEM培养液中于37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养，每3～4 d传代1次。所有实验均在细胞处于对数增长期时进行。

1.3 克隆形成实验检测细胞集落形成情况

取对数生长期细胞接种于6孔板。细胞培养24 h后，10 μmol/L AG1024温育处理细胞24 h后，6 MV X线分别照射0、2、4、6、8、10 Gy，1 h后按不同浓度梯度接种于6 cm培养皿中培养2周。细胞集落经4%多聚甲醛溶液固定以及0.1%结晶紫染色后，显微镜下观察细胞集落形成情况。以含>50个细胞的集落计为1个存活克隆，计数各组细胞的克隆数。应用Sigma plot多靶单击模型拟和存活曲线。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI 双标记法分析细胞凋亡

取对数生长期FaDu细胞接种于6孔板。培养24 h后，分别给予如下处理： ①对照组，不处理；②放射组，给予6 MV X线 4 Gy照射；③AG1024组，给予10 μmol/L AG1024；④联合组，给予10 μmol/L AG1024温育1 h，给予6 MV X线 4 Gy照射。各组于24 h后用胰酶消化，PBS洗涤细胞2次，收集细胞。用500 μL结合缓冲液悬浮细胞后，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC/PI混匀，再加入5 μL碘化丙啶(propidiumiodide，PI)混匀，避光反应15 min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 PI单染法分析周期分布

细胞收集方法如上，预冷的70%酒精固定过夜，再用预冷的PBS洗涤2次，加入50 μg/mL的用PBS稀释的PI工作液，避光冰浴30 min，使用流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 γ-H2AX形成实验分析DSBs修复情况

取对数生长期细胞于24孔板内爬片，培养24 h后加入10 μmol/L AG1024温育24 h，6 MV X线 4 Gy照射。于照射后0.5、1、6、24 h分别固定，破膜，封闭，染色，检测γ-H2AX焦点的表达。荧光显微镜下观察计数γ-H2AX焦点形成数，计数50个细胞取平均值。

1.7 Western blot检测IGF-1R下游活化蛋白pAkt和pErk1/2的表达

用4 ℃预冷PBS洗涤各组细胞3次后，冰上裂解蛋白30 min，收集蛋白裂解液，12 000×g离心15 min，收集上清液。采用BCA法测定蛋白浓度后，将蛋白与5倍的上样缓冲液混匀，煮沸5 min，蛋白上样量为20 μg，行SDSPAGE分离蛋白；然后将蛋白转印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用5%脱脂牛奶于室温下封闭l h，TBST缓冲液清洗3次(每次5 min)；分别加入相应一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃摇晃培育过夜后，TBST清洗3次；加入辣根过氧化物酶标记的兔或鼠二抗(1∶5 000稀释)，室温温育l h，TBST清洗3次；电化学发光试剂盒显影约5 min，曝光反应。

1.8 动物实验

4～6周龄的裸鼠，右下肢皮下注射2×107的细胞悬液0.1 mL，V=π/6ab2，其中a为长轴直径，b为其垂直的短轴直径。到肿瘤长至100 mm3时分成4组：对照组；AG1024组；放射组；联合组。AG1024每周使用5次，每次用量为30 μg 腹腔注射，使用2周，第1、8天分别用8 Gy照射，共照射2次。

1.9 统计学处理

所有实验均重复3次，采用SPSS 13.0软件进行数据分析，两组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 AG1024对FaDu细胞克隆形成的影响

FaDu细胞经AG1024温育24 h后接受照射与放射组比较，其存活曲线明显下降，肩区变窄。放射组的D0值为2.44，联合组下降为1.77。细胞在10%存活处的DMF为1.25。AG1024可以提高FaDu细胞的放射敏感性(图1)。

2.2 AG1024对FaDu细胞凋亡的影响

对照组凋亡细胞比例为(1.97±0.60)%，放射组为(3.2±0.99)%，AG1024组为(4.50±0.38)%，联合组为(9.68±0.53)%。联合组细胞凋亡明显高于放射组及AG1024组(P<0.05，图2)。

2.3 AG1024对FaDu细胞周期分布的影响

FaDu 细胞经过不同的处理后，其细胞周期发生了改变(图3)。细胞经过药物处理后，S期细胞减少；联合照射后，能进一步使G0/G1期细胞比例升高，细胞阻滞于G0/G1期。与放射组相比，联合组的细胞发生G0/G1期阻滞(P<0.05)，S期细胞比例明显降低(P<0.05)。

2.4 γ-H2AX形成实验DSBs修复情况

联合组FaDu细胞经 AG1024温育24 h后，6 MV X线4 Gy照射，放射后0.5、1、6、24 h的γ-H2AX焦点形成数为(35.20±5.93、33.10±6.71、25.92±5.79和13.33±3.93)，照射组为(32.91±5.83、31.68±6.02、20.72±6.09和3.43±2.04)。照射后0.5、1、6 h两组焦点数相比差异无统计学意义(P>0.05)。照射24 h后，联合组的焦点数明显多于放射组(P<0.05)。AG1024能抑制DSBs的修复(图4)。

2.5 AG1024对IGF-1R下游活化蛋白pAkt和pErk1/2表达的影响

Western blot检测结果显示，10 μmol/L AG1024处理FaDu细胞后，AG1024组以及联合组的IGF-1R下游的活化蛋白pAkt和pErk1/2表达下降(图5)。

2.6 AG1024对荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响

肿瘤体积双倍时间在对照组、放射组、AG1024组及联合组分别为4.3±0.21、7.1±0.25、5.2±0.19和10.9±0.24，与放射组和AG1024组相比，联合组的肿瘤生长延迟(P<0.05，图6)。

3 讨 论

头颈鳞癌在我国的发病率呈现上升趋势，进年来随着分子生物学的发展以及分子靶向药物的不断涌现，靶向治疗日渐成为头颈鳞癌治疗的重要选择。其中EGFR在95%～100%的头颈鳞癌中存在过表达。放疗或者化疗联合EGFR的靶向治疗在头颈鳞癌的治疗中取得一定的成效，但是临床发现有很大一部分患者存在EGFR耐药［4］。针对EGFR靶点治疗的局限性，寻找头颈鳞癌的更多的相关靶点的治疗势在必行。其中IGF-1R作为酪氨酸蛋白激酶家族的成员，在头颈鳞癌中多是高表达，Jun等［5］发现IGF-1R的高表达和进展患者的生存率相关，提示抑制IGF-1R可以作为头颈鳞癌治疗的相关靶点。

本研究结果显示，AG1024阻断IGF-1R后，能增加头颈鳞癌FaDu细胞的放射敏感性，可能和其能增强放疗引起的细胞凋亡，并能引起细胞周期阻滞在G0/G1期，使得细胞处在静止期，减少其细胞的分裂和增殖，而对放射不敏感的S期细胞则明显减少有关。进一步通过检测DNA双键断裂(DSBs)修复的情况以及IGF-1R下游蛋白的活化水平表明。AG1024能延缓DSBS的修复，并阻断P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信号通路。其中DSBs被认为是DNA最严重的损伤，射线引起的细胞损伤主要是DSBs从而进一步引起细胞凋亡以及增殖性死亡。当DSBs时，H2AX在139位迅速发生磷酸化(γ-H2AX) ，并在断裂附近形成焦点，而在DSBs修复后迅速发生去磷酸化。所以γ-H2AX形成的数量可作为衡量DSBs的指标［6-7］。有报道指出，IGF-1R抑制剂可通过下调BRCA2这个DNA损伤后同源修复(HR)的关键蛋白使得DSBs修复不足，导致高放射敏感性［7-8］。从克隆形成实验可见AG1024有放射增敏作用，但对DSBs这个射线引起的最主要的DNA致死性损伤的作用至今还没有被评估。所以我们检测了射线引起DSBs后AG1024在DSBs修复上的作用。在接受照射后，30 min到1 h γ-H2AX焦点形成数达到最高，之后随着DSBs的修复，γ-H2AX焦点数开始下降。在照射后0.5、1和6 h，焦点数没有明显差异，但是在24 h后，AG1024组的γ-H2AX焦点数明显比非处理组高，即DSBs的修复被抑制，增加放射敏感性。而P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信号通路与细胞的生存、分化、增殖和凋亡等密切相关，并与放疗阻抗相关。AG1024能抑制Akt和MAPK的磷酸化，从而能抑制IGF-1R介导的细胞增殖、分化等。而动物实验的结果则进一步验证了药物联合放疗能抑制头颈肿瘤FaDu细胞的增殖。

综上所述，IGF-1R抑制剂AG1024能抑制DSBs的修复，阻断P13K/Akt及Ras/Raf/MAPK信号通路，增加放疗引起的细胞凋亡。为临床寻找有效的以IGF-1R为靶点的头颈鳞癌治疗提供了实验依据。

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