联合检测炎症因子IL－6、TNF－α和 MCP－1对冠心病临床诊断价值

黄 山，张 程，陈 艳，令狐颖，许 健，刘志琴

（1.贵州省人民医院a.临床检验中心；b.心内科，贵州 贵阳550002；2.贵阳医学院09级硕士研究生）

冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或（和）因冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。“炎症假说”是动脉粥样硬化主要发病机制［1］，白细胞介素－6（IL－6）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）和单核细胞趋化因子－1（MCP－1）等炎症性因子在其过程中发挥着重要的作用。目前流式细胞仪在临床上的应用不断扩大，鉴于此本研究应用荧光微球编码技术，建立了流式微球分析技术（cytometric bead assay，CBA）联合检测IL－6、TNF－α和 MCP－1的方法，对冠心病患者血清进行检测，发现其对冠心病的诊断具有一定的临床应用价值，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源

血清标本采自2010年8月－2011年5月贵州省人民医院心内科住院病人和健康体检者。清晨空腹采血，3 000rpm×10min分离血清，－70℃保存待检。正常对照组收集50例，男30例，女20例，年龄35－55岁，平均年龄43±2.26岁，均来自各项体检指标正常的健康人群；冠心病组收集150例，男85例，女65例，年龄35－81岁，平均年龄52±1.35岁，稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组和急性心肌梗死组血清标本各50例，经冠状动脉造影术等检查确诊。

1.2 主要试剂和仪器

BD Array流式细胞仪，酶标仪和洗板机（均为北京 普 朗 公 司 产 品），人 IL－6、TNF－α 和 MCP－1 ELISA检测试剂盒（R＆D公司产品，批号分别为CK－E10140H、CK－E10110H 和CK－E10136H）等。

1.3 方法

采用SPSS13.0软件设计正交试验表和进行试验结果方差分析，对IL－6、TNF－α和 MCP－1 3种鼠抗人单克隆抗体联接羧基化微球的最佳联接量、PE标记的亲和素的稀释倍数和洗涤次数以及孵育时间、生物素标记抗体的稀释倍数和洗涤次数及孵育时间等验条件进行优化选择。以羧基化微球标记的不同的荧光素为定性基础，操作遵循仪器的说明，试验条件选择优化的实验参数，建立了流式微球联合检测IL－6、TNF－α和 MCP－1的分析技术，即可对待检血清标本进行检测。同时用IL－6、TNF－α和MCP－1ELISA法检测试剂盒对血清标本进行检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0软件设计正交试验表和进行试验结果方差分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用配对资料t检验，计数资料采用χ2检验，P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 健康对照组及冠心病组血清中IL－6、TNF－α、MCP－1检测结果 运用自建CBA方法对健康对照组及冠心病不同疾病组血清中IL－6、TNF－α、MCP－1进行检测，结果见表1。通过统计软件对健康对照组、稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组、急性心肌梗死组血清中IL－6、TNF－α、MCP－1水平进行t检验，4组两两比较其P＜0.01，说明各组血清中IL－6、TNF－α、MCP－1水平均具有显著性差异。

表1 CBA联合检测各组血清标本炎症因子结果（pg／ml）

2.2 建CBA技术与ELISA法检测结果比较 20

份血清标本中IL－6、TNF－α、MCP－1水平采用 CBA方法与ELISA法试剂盒测定，以±s（pg／mL）表示，结果见表2。对检测数据，采用配对t检验，两种方法检测结果无显著差异。

表2 自建CBA技术与ELISA法检测结果比较

2.3 自 建 CBA 技 术 联 合 检 测 IL－6、TNF－α 和MCP－1对冠心病诊断效能评价 采用SPSS13.0软件，得出CBA技术联合检测IL－6、TNF－α和 MCP－1的ROC曲线，ROC曲线下面积（AUC）分别为0.940、0.930和0.867，其 P值均小于0.01，血清中IL－6、TNF－α和 MCP－1水平用于诊断冠心病有显著意义。根据ROC曲线，选择图中最靠近左上方的点，根据统计结果在可能切点的敏感性和特异性计算敏感性＋特异性，最高值为临界值，从SPSS输出的表中查得IL－6、TNF－α和 MCP－1诊断冠心病的cut－off值分别为5.81pg／ml、7.55pg／ml和61.98 pg／ml。依 据 选 定 的 cut－off 值，IL－6、TNF－α 和MCP－1的诊断灵敏度分别为89.3%、90.7%和84.0%；特异性分别为88.0%、78.0%和82.0%；阳性似然比分别为7.44、4.12和4.67；阴性似然比为0.12、0.12和0.20，阳性预测值分别为95.71%、92.52%和93.33%；阴性预测值为73.33%、73.58%和63.08%，Youden指数分别为0.773、0.687和0.660。

2.4 IL－6、TNF－α和 MCP－1 3种因子对冠心病的联合诊断效能评价 按3种因子的cut－off值，统计健康对照组和冠心病组血清中IL－6、TNF－α、MCP－1阳性的例数，以评价单项指标和联合应用对冠心病中的诊断效能，结果见表3。根据表3数据，得出血清中IL－6、TNF－α和 MCP－1 3项指标联合应用诊断灵敏度为94%，特异性为72%。对单项指标和3项指标联合应用的灵敏度和特异性进行卡方检验，各单项指标之间的灵敏度和特异性无显著性差异，3项指标联合应用的灵敏度优于各单项指标检测的灵敏度，而3项指标联合应用的特异性与单项指标检测的特异性无显著性差异。作为一种诊断冠心病的初筛方法，流式微球联合检测法IL－6、TNF－α和MCP－1具有较高的灵敏度，可以对冠心病进行早期诊断。

表3 3种因子单项和联合应用对冠心病诊断阳性率的比较（例，%）

3 讨论

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。随着医学研究的不断深入，一些化学因子和细胞因子不断被检出，认为动脉粥样硬化的表现符合炎症表现的普遍规律，许多炎症性因子参与了动脉粥样硬化的形成过程。白细胞介素－6，主要源自活化的单核／巨噬细胞，可诱导急性期炎性反应的产生，IL－6的高低与炎症的反应程度密切相关。研究表明冠心病组与对照组之间IL－6差异有显著意义，其机制可能为：①IL－6刺激肝脏产生纤溶酶原激活物抑制剂（PAI），PAI和纤溶酶原激活物（tPA）结合并使其失去活性，导致纤溶功能低下，促进血小板聚集和血栓形成；②促使心肌细胞表达细胞间黏附因子－1（ICAM－1）增多，加快中性粒细胞（PMN）与心肌细胞的黏附过程，从而释放氧自由基，加重心肌细胞损害；③通过一氧化氮（NO）介导，使心肌细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）浓度升高，Ca2＋浓度下降，发挥负性肌力作用［2］。TNF－α在正常心肌组织中表达水平较低或不表达，心肌梗死可促使心肌组织合成TNF－a。一方面，TNF－α通过诱导基质金属蛋白酶（MMPs）表达使维持正常心肌细胞排列的胶原网降解，最终导致心室腔扩大。另一方面，TNF－α的细胞毒效应构成心室重构的特征性改变和心功能不全不断加重［3］。MCP－1作为一种特异性单核细胞趋化因子，促进单核细胞向受损的内皮细胞趋化、黏附，然后进一步迁入血管内膜下，并活化为巨噬细胞，不断吞噬类脂质，形成泡沫细胞及脂质池，成为AS的最早病变脂质条［4］。由于单核细胞的迁移是动脉粥样硬化形成的早期病理表现，因此血浆MCP－1水平是冠心病早期病理变化和斑块活动的标志物，为临床早期预测病情进展提供了依据［5］。

在炎症性标志物的检验中，方法较多，目前主要有生物活性检测法、免疫学检测法、分子生物学检测法［6，7］。近年来，流式细胞分析仪在临床不断普及，拓展流式细胞分析技术，延伸流式细胞仪应用领域，有着非常重要的意义。为此，本文建立流式微球分析技术联合检测IL－6、TNF－α和 MCP－1的方法。通过对流式微球联合检测法和ELISA法检测血清中的IL－6、TNF－α、MCP－1的结果进行配对t检验，P值均大0.05，说明两种检测方法无显著差异。但有着ELISA无法比拟的优越性：通量大；标本利用率高；特异性强；敏感度高，线性范围宽，重复性好；液相反应 ；节约人力资源，操作简便、快捷、耗时短。根据IL－6、TNF－α、MCP－1检测的 ROC曲线，其面积分别为0.940、0.930和0.867，在 AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好，并且各因子的诊断灵敏度、特异性、阳性似然比、阳性预测值、阴性预测值和Youden指数等指标均较为满意，3项指标联合应用具有较高的灵敏度，可用于对冠心病进行早期诊断，值得在临床上推广使用。

［1］Reiss AB，Glass AD.Atherosclerosis：immune and inflammatory aspects［J］.J Investigate Med，2006，54（3）：123.

［2］宋清玲，雷光文.冠心病患者血清IL－6及CRP检测的临床意义［J］.放射免疫学杂志，2011，24（03）：357.

［3］李志霞，陈月梅，晏小敏，刘海娟.老年冠心病IL－6、TNF－α血清水平测定及意义［J］.北方医药，2011，8（02）：89.

［4］张录站，陈忠，马根山.早发冠心病患者血浆 MCP－1水平检测及其临床意义［J］.现代医学，2008，36（03）：170.

［5］Deo R，Khera A，McGuire DK，et al.Association among plasma levels of monocyte chemoattractant protein－1，traditional cardiovascular risk factors，and subclinical atherosclerosis ［J］.J Am Coll Cardiol，2004，44：1812.

［6］沈关心，周汝麟.现代免疫学实验技术［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1998.

［7］李影林.中华医学检验全书［M］.北京：人民卫生出版社，1996.