PCR指纹图谱分析在念珠菌性阴道炎、龟头炎流行病学研究中的应用

江爱萍 黄剑清 卢万丁 徐明 吴建华

(1.福州市皮肤病防治院，福州350025;2.上海长海医院皮肤科，上海200433)

念珠菌性阴道炎和龟头炎是指由念珠菌感染引起的外阴部感染。念珠菌性阴道炎是育龄期妇女的常见疾病，80% ～90%的病原体为白念珠菌［1］，经系统正规的治疗可痊愈。但由于多种原因，常复发难以根治，形成复发性念珠菌性阴道炎(RVVC)。复发性念珠菌性阴道炎指妇女单纯性念珠菌阴道炎经治疗后，临床症状和体征消失，真菌学检查阴性后再次出现症状，经真菌学检查又呈阳性或1 a内反复发作4次或以上，其病原菌主要是白念珠菌，是妇科的常见病［1-2］。但是，目前临床上缺乏一种对念珠菌性阴道炎及龟头炎的发病及复发后的病原体进行鉴定的手段，因此建立一种快速、准确的实验检测方法就显得尤为必要。微卫星又称简单重复序列 (Simple Sequence Repeat，SSR)，或短串联重复 (Short Tandom Repeats，STRs)，是20世纪80年代末期继限制性内切酶片段长度多态性之后发展起来的一种新型分子标记技术。以1～10 bp短核苷酸序列 (一般称作核心序列)为基本单位，呈10～20次串联重复状广泛随机地分布于生物体的整个基因组。本文对16例RVVC患者前后两次感染及3对夫妻同时感染分离的共22例病原体进行微卫星PCR扩增，并对PCR指纹图谱进行了分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年12月～2010年11月来我院门诊就诊并确诊为复发性念珠菌性阴道炎的患者以及夫妻双方同时感染念珠菌的患者分离出的菌株。经登记、取材、培养、菌种鉴定、保存备用。

1.2 菌种的分离和鉴定

将标本接种于沙氏培养基，37℃孵育48 h。挑取沙氏培养基平板上单菌落，划线接种到真菌显色培养基上，37℃孵育24 h。显色结果作为初步鉴定依据(白念珠菌菌落呈淡绿色)。采用API 20C AUX系统将所有实验标本鉴定到种，确定22株实验菌株中，19株 (86%)为白念珠菌;3株 (14%)为光滑念珠菌。

1.3 基因组DNA提取

挑取真菌单菌落，接种至3 mL沙氏液体培养基中，35℃，150 r/min振荡孵育18 h。菌液浓度调至1～2×107CFU/mL时，使用TIANGEN真菌/酵母细胞裂解液，TIANGEN酵母DNA抽提 (小量)试剂盒抽提基因组DNA。0.8℅琼脂糖凝胶电泳，140 V恒压，25 min。BIO-RAD全自动凝胶成像分析仪上紫外拍照，显示2.5 kb左右的高亮条带。

1.4 微卫星PCR

引物:5'-GACA GACA GACA GACA-3'，由上海生工合成。25μL反应体系中含:10×PCR Buffer 2.5 μL，引物 (10 μmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP Mixture(各 10 mmol/L)0.5 μL，Taq DNA polymerase 1 μL，模板DNA:25～30 ng，补足ddH2O至25μL。扩增条件:95℃预变性5 min;94℃ 40 s，45℃ 1 min，72℃ 1 min 循环 35 次，72℃延伸10 min。扩增产物各取10μL加样于1.5%琼脂糖凝胶，在140 V恒压下电泳20 min。BIO-RAD全自动凝胶成像分析仪上紫外拍照。

1.5 聚类分析

将拍摄成像的电泳图像按条带有无分别赋值1和0，转换为数值矩阵，然后用Ntsys 2.10e分析软件进行遗传相似性分析。该分析系统逐一比较两个泳道每一条带的位置关系，计算这两株菌电泳条带的相似系数 (similarity coefficient，Sab)。Sab值越大说明两者的亲缘关系越近，考虑到实验误差，一般Sab≥0.8则认为该两株菌株具有基因同源性，可被认定为同一株菌。并用此值作为界限将具有基因同源性的菌株分为若干族 (cluster)［3］，并按照UPMGA法构建系统进化树。

2 结 果

2.1 菌种的分离和鉴定结果

共分离鉴定出22株念珠菌。其中白念珠菌19株;光滑念珠菌3株(其中两株为同一患者前后两次感染分离所得，另一株为夫妻双方同时感染，配偶一方感染分离所得，见表1)。

表1 实验菌株编号及其来源Tab.1 Source of Candida strains

2.2 单引物PCR扩增产物电泳结果

22株念珠菌的DNA经单引物PCR扩增，所得PCR产物电泳带型稳定，多态性较高，获得了较为稳定的PCR指纹图谱。扩增的条带数5～9条之间，大小介于100～2 000 bp(见图1)。

图1 22株念珠菌的PCR产物电泳图谱 (M.DNA长度标记，从小到大依次为 100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1 000 bp、2 000 bp)Fig.1 PCR fingerprinting of 22 strains(M.DNA marker)

2.3 各菌株间相似系数

22株不同菌株之间的PCR扩增条带数量和扩增片段的大小存在差异，采用Ntsys 2.10e分析软件，对同一患者前后2次分离的菌株及夫妻同时分离的菌株进行相似系数分析 (Sab)，数值介于0.5及1.0之间 (见表2)。其中A1-1与A1-2，A6-1与A6-2，A2-1 与 A2-2，A7-1 与 A7-2，B1-1 与 B1-2，B2-1与B2-2，B3-1与 B3-2的相似系数大于0.8，可认为是同一菌株的复发或传染。

表2 同一患者前后2次分离菌株及夫妻患者分离菌株相似系数Tab.2 Similar coefficient for intergroup comparison of the same patient or couples

2.4 各菌株的聚类树状图

依据22株不同菌株的PCR扩增条带数量和扩增片段的大小，采用NTsys 2.10e分析软件对22株菌株进行分析后形成的聚类树状图 (见图2)。其中A1-1与A1-2，A6-1与A6-2亲缘关系最近，与相似系数的分析结果一致。

图2 各菌株的聚类树状图Fig.2 Dendrogram for all 22 isolates from patients

3 讨 论

目前认为RVVC反复发作的主要原因有:前次治疗未彻底杀灭阴道腔和阴道上皮细胞内的念珠菌，数周或数个月后上皮细胞成熟过程中残存念珠菌随脱屑细胞再次进入阴道腔并繁殖;性伴侣常携带念珠菌而无症状;肠道念珠菌感染引起肛周繁殖;机体免疫功能下降;其他一些高危因素，如糖尿病及长期服用激素类药物等［4-6］。即RVVC可分为传染、复发及再感染三个主要原因。由于传染、复发及再感染所致的念珠菌性阴道炎和龟头炎的临床治疗方法不同，因此对念珠菌性阴道炎及龟头炎的发病原因进行甄别就显得尤为重要。同时，对于念珠菌性阴道炎及龟头炎的临床诊治有着非常重要的指导的意义。通常对于复发的病例需要调整治疗方案，比如选择敏感药物、加大剂量或延长疗程。而对于再感染或性伴间传播的病例，则需要对患者加强卫生宣教，注意个人卫生比用药更重要。

本文中，我们采用微卫星序列进行了PCR扩增指纹图谱法对临床上的16例前后两次感染的菌株及6例同时感染的夫妻分离出的菌株进行分析。其中，4例即两位患者前后感染的菌株的指纹图谱相似系数达到了1.0;一对夫妻同时感染的菌株分别为白念珠菌和光滑念珠菌，相似系数仅为0.5;另16例，两两间的相似系数在0.6～0.9之间。不同的引物所扩增出来的条带对实验结果也有一定的影响，根据张有江等［7］的研究结果表明，使用引物M13 扩增时，种间 Sab为0 ～0.75，种内 Sab为 0.85 ～1.0;使用引物 T3B 时，种间 Sab为0 ～0.67，种内 Sab为0.90～1.0。两菌株间的相似系数越大则亲缘性越强。由于药物选择作用等的影响，再次引起发病的病原体的遗传性状在一定程度上有所改变［8-9］，加上PCR实验误差，一般认为相似系数大于0.8的两株菌为同一株菌。在预实验中，我们采用了M13通用引物、(GCA)5、(GACA)4三个微卫星序列作为引物进行PCR扩增，仅(GACA)4扩增出来的序列的多态性比较明显，可能由于菌株基因组序列的突变所致。针对一个微卫星序列引物扩增出来的序列，可由于菌株一些位点突变导致一定的误差。那么，对多位点微卫星序列进行分析，得到的指纹图谱则可能更为可靠，但是还有待于进一步细致的研究。

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