纳米材料的抗真菌活性及其机制研究进展

苗琦 曹永兵 张石群 林辉 姜远英

(第二军医大学药学院药理学教研室，上海200433)

真菌是自然界中广泛存在的一种真核微生物，其中可致人体疾病的真菌大约有200多种，属于条件致病菌［1］。近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，外科介入疗法的逐渐增多以及肿瘤放疗、化疗的影响，使得原来发生率较低的深部真菌感染近年来有逐渐抬头的趋势［2］。在抗真菌药物非常有限的情况下，耐药真菌的出现无疑给本就步履维艰的临床治疗雪上加霜［3］。针对这一现象，科学家们另辟蹊径将目光转向了纳米材料。以纳米银粒子为例，由于纳米银粒子的表面效应，其抗真菌能力是相应微米银粒子的200倍以上，因而添加纳米银粒子制成的医用敷料对诸如白念珠菌等临床常见真菌有较好的抑制作用。本文将对近年来纳米材料的抗真菌活性及其机制的研究进展作一综述。

1 纳米材料的特性

纳米材料即粒径为1～100 nm的纳米粉、纳米线、厚度为1～100 nm的纳米薄膜，并能出现纳米效应的材料［4］。由于纳米材料的颗粒极其微小，使其在物理、化学、电子、生物等方面与大分子相比有显著的特异性，因而在航天航空、医药、化妆品、电子及抗菌消毒等方面具有广泛的应用前景［5］。众所周知，直径小于100 nm的纳米材料能够进入细胞;小于40 nm的纳米材料可以进入细胞核;当小于35 nm时就可以通过血脑屏障［6］。

纳米材料与同样容积的大颗粒相比有很大的比表面积。举例说明，如果1立方厘米切割成边长为1 nm的1021个立方体，则切割后的总质量和总体积不变，但是表面积却增加了1 000万倍［7］!图1说明了纳米粒子粒径大小与比表面积之间成负相关的关系。正是由于这些特性使纳米材料拥有很多效应:表面效应、量子尺寸效应、体积效应、宏观量子隧道效应、界面相关效应［1］。

图1 纳米粒子粒径大小与比表面积之间成负相关的关系(例如，当纳米直径为30 nm时比表面积值为10%左右，而当粒径缩小到3 nm时，比表面积增大到50%左右［8］)Fig.1 Inverse relationship between particle size and number of surface expressed molecules.For instance，in a particle of 30 nm size，about 10%of its molecules are expressed on the surface，whereas at 3 nm size the ratios increase to 50%

2 主要的纳米抗真菌材料及其抗真菌机制

2.1 金属型纳米抗真菌剂

纳米银是目前研究较多的纳米抗真菌材料。从远古时代，人们就知道银及其复合物能够有效地对抗微生物，利用银可以加速伤口愈合、治愈感染、净化水和保存食物饮料等［9］。Panacek 等［8］研究发现纳米银对革兰阳性菌、革兰阴性菌甚至是多元耐药菌株都有很强的杀菌作用。郑丛龙等［10］的实验结果表明纳米银对白念珠菌、黄曲霉和黑曲霉有明显的抑制作用，使用0.06%纳米银溶液室温下作用10 min时，对白念珠菌的抑菌率为92.0%，而对黄曲霉和黑曲霉的抑制率仅为5% ～6%。而当室温下作用30 min后，对白念珠菌、黄曲霉和黑曲霉的抑制率均大大提高，可以达到100%，以上实验说明纳米银对白念珠菌、黄曲霉和黑曲霉的抑制作用与其剂量和作用时间密切相关。Kim 等［11］证明了纳米银 (MIC80，1 ～7 μg/mL)能够抑制须癣毛癣菌以及白念珠菌临床株和标准株的生长，其活性虽然与两性霉素B(MIC80，1～5 μg/mL)相当，但是比氟康唑(MIC80，30μg/mL)强很多，除此之外还发现纳米银对菌丝态的活性比酵母态强。

有关纳米银抗真菌作用的机制是相当复杂的。但多数学者认为银离子在纳米银的杀菌过程中发挥了不可磨灭的作用。Dibro等［12］的观点认为，纳米银颗粒的直径非常小 (10～100 nm)，能够凭借其独特的尺寸效应和表面效应轻而易举地到达细胞膜，穿透细胞壁进入细胞内。由于纳摩尔水平的纳米银的表面积极大，在水溶液中容易发生反应:Ag=Ag++e-。银离子进入病原体后迅速地与菌体中的酶蛋白巯基(-SH)结合，使一些以此为必要基团的酶失去活性，致使细胞丧失分裂繁殖能力而死亡，从而起到了杀灭真菌、修复组织、加速伤口愈合、治疗感染的作用。Feng等［13］的研究发现的银离子抗菌机制为纳米银处理伤口后，银离子可与致病菌中的DNA碱基相结合形成交叉链接，进而置换嘌呤和嘧啶中与氮相邻的氢键，使真菌DNA结构发生改变，丧失复制能力，导致致病菌失去活性，从而达到杀灭真菌的作用。而Kim等［14］的观点则认为纳米银与真菌表面的蛋白质分子发生结合，产生变性反应，裂解质子泵，使膜蛋白或磷脂双分子层的通透性增强，H+容易外漏，导致真菌的细胞膜裂解而发挥杀菌作用。程定超等［15］认为纳米银的抗真菌活性还与纳米银中的银离子与真菌中的-NH、-COOH等反应有关。

2.2 光催化型纳米抗真菌剂

光催化型纳米抗真菌剂是指以纳米二氧化钛为代表的，具有光催化性能的一类半导体无机材料，其他还包括纳米氧化锌、纳米碳化硅等，以及相互之间的复合物等［16］。

纳米二氧化钛 二氧化钛 (TiO2)是一种白色无毒的金属氧化物，其主要有锐钛矿、板钛矿和金红石三种结构形态类型，其中锐钛矿型TiO2具有光催化活性，尤其是它的粒径降到纳米级的时候光催化效果比微米级强很多，称为纳米TiO2。隆泉等［17］通过三角瓶震荡实验法研究发现，纳米TiO2对金黄色葡萄球菌及白念珠菌均有抑制作用，且纳米TiO2的抗菌性能明显高于微米级的TiO2;还有实验研究发现40 mg/L纳米TiO2光照作用 24 h后可以灭活大部分白念珠菌［18］。Maneerat等［19］用纳米 TiO2粉末和涂有 TiO2的塑料薄膜对青霉菌和腐烂的果实进行体外实验，将青霉菌孢子和TiO2粉末均加入到马铃薯葡萄糖琼脂板(PDA)中，发现光催化型TiO2能够有效地减少孢子的形成。另外，随着TiO2量的增加，通过光催化反应抑制青霉菌的能力越强，培养基中活的菌落数越少。因此，涂有纳米TiO2的塑料薄膜可以有效减少青霉菌对柠檬、苹果等果实的侵染。方明等［20］通过对6种不同的不溶性无机抗菌剂采用液体稀释法发现，纳米TiO2抗菌剂具有明显的抗白念珠菌的功效，且纳米载银抗菌剂比纳米TiO2抗菌剂抗白念珠菌效能更强。

纳米TiO2是一种半导体光催化型抗菌剂，其抗真菌机制主要是纳米TiO2由传导电子的导带、充满电子的价带和不能存在电子的禁带构成［21］，在紫外光的照射下，当能量大于其带隙能时，纳米TiO2即自行分解产生带负电的电子 (e-)和带正电的空穴 (h+)，形成空穴-电子对，其中电子(e-)使吸附溶解在TiO2表面的O2还原形成氧原子 (·O)，而空穴 (h+)则将吸附在TiO2表面的OH-和H2O氧化成氧原子 (·O)和羟基自由基(·OH)［22］。由于羟基自由基具有强氧化能力，可以氧化分解构成真菌的主要成分的各种有机物生成CO2和H2O，干扰真菌蛋白质的合成，从而有效地抑制真菌的生长，因此具有很好的消毒杀菌的功能。同时纳米TiO2作为光催化抗菌材料，在抗菌过程中仅作为催化剂，理论上没有消耗，可重复使用。

纳米氧化锌 氧化锌(ZnO)是一种无机金属型氧化物，能够补充人体必须的矿物元素锌，而且纳米ZnO与人体细胞有很好的组织相容性，并且具有持久耐用、高度选择性、耐高温等优点。在目前研究的众多无机金属型氧化物 (如TiO2，MgO，CaO and ZnO等)中，ZnO由于其独特的性质表现出广泛的应用前景。Deepali［23］等通过将真菌(Fusarium sp.)涂抹到含有不同浓度的纳米ZnO的SDA平皿上的实验方法，发现纳米ZnO有明显的抗真菌活性。

Brayner［24］认为纳米ZnO的抗真菌活性可能与其在纳米结构的表面形成了自由基有关，通过自由基破坏真菌的生物膜。2010年Lili等［25］研究了纳米ZnO对P.expansum和B.cinerea的抗真菌活性，并用扫描电镜和拉曼光谱做了相关机制研究。发现当纳米ZnO的浓度大于3 mmol/L时就能明显的抑制P.expansum和B.cinerea的生长。同时还发现纳米ZnO对两种植物真菌的抗菌机制可能不同。纳米ZnO是通过摩擦真菌B.cinerea使菌丝变形来发挥抗真菌活性，而对P.expansum则是通过抑制分生孢子的生长来抑制真菌生长。

2.3 复合型纳米抗真菌剂

目前，绝大多数的纳米抗真菌材料使用的是单一的纳米抗菌剂，它们各自都有一定的局限性，如纯度高的纳米银价格较昂贵，对正常细胞是否也具有杀伤作用等本身的毒理学与安全性问题都还有待作进一步研究。而光催化型纳米抗真菌剂如纳米TiO2的杀菌功能则必须借助紫外光线才能起作用，这样就先限制了它的应用范围。因此，复合型纳米抗真菌剂的研究就显得格外重要。

壳聚糖季铵盐/有机累托石纳米复合材料 王小英等［26］通过溶液插层法合成了壳聚糖季铵盐/有机累托石纳米复合材料。并通过抑菌活性实验、杀菌实验等发现在pH=5.4的醋酸缓冲溶液、水及pH=8的NaOH条件下对黄曲霉、革兰阳性菌、革兰阴性菌的抗菌性能都大大提高。证实了壳聚糖季铵盐/有机累托石纳米复合材料能有效结合两者的抗菌能力，比单一物质的抗菌性能强。

此外，王小英课题组还通过扫描电子显微镜(TEM)和透射电子显微镜(SEM)研究了壳聚糖季铵盐/有机累托石纳米复合材料的抗菌机制。发现抗菌过程为:首先，经CTAB改性的累托石与壳聚糖季铵盐插层复合形成的疏水性的复合材料具有高正电荷密度。一方面，正电荷有助于纳米复合材料通过静电作用与真菌相吸附。另一方面，CTAB、壳聚糖季铵盐的疏水基团与真菌细胞壁的脂蛋白、磷脂等亲脂成分发生疏水性作用。正是这两方面的作用使真菌能够有效地吸附并固定到复合材料表面。然后，带正电荷的壳聚糖季铵盐与带负电荷的细胞表面形成复合物，改变细胞膜的通透性，从而达到抑制真菌生长的目的［27］。

TiO2/ZnO纳米复合材料 以纳米TiO2为基础的复合材料能够解决单一纳米TiO2必须借助紫外光线才能起作用的不足。纳米ZnO由于其表面化学活性也具备了抗真菌活性，因此成为与纳米TiO2相复合的不二之选。Haghighi等［28］用化学气相沉积的方法合成了TiO2/ZnO纳米复合材料，并且通过纸片扩散等实验证实了这种复合材料能够在可见光下有效地光降解白念珠菌的生物膜，很好地抑制白念珠菌的繁殖。

载银纳米复合材料 载银纳米复合材料的类型多种多样。载银纳米TiO2是纳米TiO2的一种改性产物，利用分子活化作用，将银嵌入锐钛型TiO2晶体，使TiO2在光线暗处也具有抗真菌性能，从而提高纳米TiO2的光催化活性。李斌等［29］采用肉汤稀释法、测定抗菌率法等发现载银纳米TiO2抗菌粉对白念珠菌的最小抑菌浓度为20 mg/mL。Fe3O4被用来研究抑制引起脑部疾病的灰绿曲霉。实验得出载银纳米Fe3O4对灰绿曲霉的MIC值为2 000 μg/mL。

载有抗真菌药物的纳米材料 将已知的具有抗真菌活性的药物制备成纳米材料是更为直接有效地提高药物抗真菌能力的方法。朱丽君等［30］采用透析法将两性霉素B制成两性霉素B/聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯嵌段共聚物 (AmB/PEG-b-PBLA)纳米胶束，并通过微量液基稀释法发现AmB/PEG-b-PBLA胶束的最低抑菌浓度只有两性霉素B注射剂的1/8～1/4，抗真菌活性明显高于两性霉素B注射剂 (P ＜0.05)。

3 纳米材料的抗真菌研究的展望

在国内、外的研究报道中，对各种纳米材料抗真菌性能的研究较多，但是有关它们抗真菌机制的资料很少，尤其国内的研究更薄弱，一些该方面的实验也正处于进行之中，因此系统地研究单一纳米材料及复合型的纳米材料 (如载银的纳米TiO2)对真菌的杀灭效果及机制探讨将是一个具有突破性的发展方向。另外，现今的纳米抗菌剂与普遍使用的有机抗菌剂相比，一个关键的缺陷是即效性相对较差，因此进一步的研究也可考虑将多种抗菌材料复合或进行材料的改性以使其快速杀菌，从而也使纳米技术与消毒灭菌技术的结合应用更加完善。

美国伯明翰大学的菲力普教授指出:“纳米技术最终目的还在于生活本身。”全世界的科学家已经把目光转向纳米技术在人们生活中的应用，尤其是在提高人们生活质量的生物医学领域的应用研究。在现有研究成果的基础上一定会研究出更多，更有效的抗真菌纳米材料，为临床真菌的治疗提供更广阔的应用前景。

［1］ Garber G.An overview of fungal infections［J］.Drugs，2001，61(1):1-12.

［2］ Mart KA，Lyons CN，Ha K，et al.Inducible azole resistance associated with aheterogeneous phenotype in Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(1):52-59.

［3］ Boschman CR，Bodnar UR，Tornatore MA，et al.Thirteen-year evolution of azole resistance in yeast isolates and prevalence of resistant strains carried by cancer patients at a large medical center［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(4):734-738.

［4］ Bai CL.Nanotechnology and development prospect［J］.Chinese Science Bulletin，2001，46(2):89-92.

［5］ Pooja J，Zafar KK，Esha B，et al.Variation in random amplified polymorphic DNA(RAPD)profiles specific to fluconazole-resistant and sensitive strains of Candida albicans［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2001，41(3):113-119.

［6］ European Medicines Agency，2010.1st international workshop on nanomedicines2010，Summary report［online］.Available:http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Report/2010/10/WC500098380.pdf［Accessed 14 April 2011］.

［7］ Kim BY .Nanomedicine［J］.N Engl J Med，2010，363(25):2434-2443.

［8］ Panacek A，Kvitek L，Prucek R，et al.Silver colloid nanoparticles:synthesis，characterization，and their antibacterial activity［J］.J Phys Chem，2006，110(33):16248-16253.

［9］ Klasen HJ.A historical review of the use of silver in the treatment of burns II.Renewed interest for silver［J］.Burns，2000，26(2):131-138.

［10］ 郑丛龙，周广任，景立新，等.纳米银体外抗真菌作用的实验研究［J］.中华现代医学与临床，2007，6(3):50-51.

［11］ Kim KJ，Sung WS，Moon SK，et al.Antifungal effect of silver nanoparticles on dermatophytes［J］.JMicro Biot，2008，18(8):1482-1484.

［12］ Dibro P，Dzioba J，Gosink KK，et al.Chemiosmotic mechanism of antimicrobial activity of Ag(+)in vibvio cholerae［J］.Antimicob Agents Chemother，2002，46(8):2668-2670.

［13］ Feng QL，Wu J，Chen CQ，et al.A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus oureus［J］.Biomed Mater Res，2000，52(4):662-668.

［14］ Kim J，Lee J，Kwon S，et al.Preparation of biodegradable polymer/silver nanoparticles composite and its antibacterial efficacy［J］.Nanosci Nanotechnol，2009，9(2):1098-1102.

［15］ 程定超，杨洁，赵艳丽.纳米银抗菌材料在医疗器具与生活用品中的应用［J］.医疗卫生装备，2004，25(11):27-30.

［16］ Nariki Y，Inoue Y，Tanaka K.Production of ultra fine SiC powder from SiC bulk by arc-plasma irradiation under different atmospheres and its application to photocatalysis［J］.J Mater Sci，1990，25(7):3101-3104.

［17］ 隆泉，郑保忠，周应揆.新型纳米无机抗菌剂的抗菌性能研究［J］.功能材料，2006，2(37):274-276.

［18］ 李蓓，赵铱民.比较纳米载银抗菌剂与纳米二氧化钛抗菌剂抗白色念珠菌性能的实验研究［J］.临床口腔医学杂志，2008，24(2):70.

［19］ Chamorn M，Yasuyoshi H.Antifungal activity of TiO2photocatalysis against Penicillium expansum in vitro and in fruit tests［J］.Int J Food Microbiol，2006，(107):99-103.

［20］ 方明，陈吉华，徐修礼.不同种类无机抗菌剂对口腔致病菌抗菌性能比较及其检测方法探讨［J］.口腔医学研究，2006，22(1):12-14.

［21］ Karvinen S，Hirva P，Pakkanen A.Ab initio quantum chemical studies of cluster models for doped anatase and rutile TiO2［J］.JM of Struc-Theochem，2003，626(2):271-277.

［22］ Chamorn M，Yasuyoshi H.Antifungal activity of TiO2photocatalysis against Penicillium expansum in vitro and in fruit tests［J］.Food microbiology，2006，107(2):99-103.

［23］ Deepali S，Jaspreet R，B.S.Kaith，et al.Synthesis of ZnO nanoparticles and study of their antibacterial and antifungal properties［J］.Thin Solid Films，2010，519(3):1024-1229.

［24］ Brayner R，Ferrari-Iliou R，Brivois N，et al.Toxicological impact studies based on Escherichia coli bacteria in ultrafine ZnO nanoparticles colloidal medium［J］.Nano Lett，2006，6(4):866-870.

［25］ Lili H，Yang L，Azlin Mustapha，et al.Antifungal activity of zinc oxide nanoparticles against Botrytiscinerea and Penicillium expansum［online］.Available:www.sciencedirect.com

［26］ 王小英，杜予民，孙润仓，等.壳聚糖季铵盐/有机累托石纳米复合材料的抗菌性能研究［J］.无机材料报，2009，24(6):1236-1242.

［27］ Helander IM，Nurmiaho-Lassila EL，Ahvenainen R，et al.Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gram-negative bacteria［J］.Int J Food Microbiol，2001，71(2-3):235-244.

［28］ Haghighi N，Abdi Y，Haghighi F，et al.Light-induced antifungal activity of TiO2nanoparticles/ZnO nanowires［J］.Applied Surface Science，2011，257(23):10096-10100.

［29］ 李斌，任艳云，徐立群.载银纳米二氧化钛树脂基托光触媒的抗真菌作用［J］.中国美容医学，2009，18(11):1657.

［30］ 朱丽君，潘仕荣.两性霉素B/聚乙二醇-聚天冬氨酸苄酯嵌段共聚物纳米胶束的制备与性能［J］.中国药学杂志，2010，45(5):359-365.