地黄饮子对海马神经元缺氧损伤的保护机制

李子军， 刘春娜

（辽宁医学院，辽宁锦州 121001）

地黄饮子对海马神经元缺氧损伤的保护机制

李子军， 刘春娜*

（辽宁医学院，辽宁锦州 121001）

目的 观察地黄饮子 （熟地黄、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉等）对缺血缺氧损伤海马神经细胞的保护作用并探讨机制。方法 将培养细胞分为对照组、模型组及药物保护组；其中，损伤组采用Na2S2O41 mmol/L加低糖作用3 h；药物保护组在加入损伤因素同时加入不同浓度含地黄饮子血清。通过比色法测定培养液中乳酸脱氢酶含有量（LDH），采用MTT法测定脑海马神经细胞存活率，利用线粒体内琥珀酸脱氢酶 （SDH）含有量来分析地黄饮子的保护作用及其作用的有效浓度；测定缺血缺氧损伤下海马神经细胞内超氧化物歧化酶 （SOD）与丙二醛 （MDA）含有量。结果 含地黄饮子血清与空白血清比例在1∶3～3∶1之间，均对缺氧神经细胞具有保护作用。降低损伤细胞LDH释放，细胞膜损伤程度减轻。MTT值不同程度升高，提示细胞活力状态提高、细胞能量代谢过程有所改善；地黄饮子可以保护缺血缺氧环境中海马神经细胞内SOD的活力，降低MDA的含有量，而且随剂量的增加而增加。结论地黄饮子对缺氧损伤脑海马神经细胞有明显保护作用；其作用机制可能与降低氧自由基损伤有关。

地黄饮子；海马神经细胞；缺血缺氧；氧自由基

地黄饮子出自金元四大家之首刘完素的《黄帝素问宣明论方》，用于治疗下元虚衰，痰浊上泛，壅塞窍道的暗痱证［1］。目前地黄饮子对神经细胞缺血、缺氧损伤的保护作用已有报道，但是具体机制目前仍不明确。本实验通过观察其对急性缺氧损伤脑海马神经细胞的保护作用，在细胞水平阐述地黄饮子的抗缺血、氧损伤作用并探讨可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 新生24 h的SD乳鼠、Wistar大鼠 （辽宁医学院科学实验动物中心提供）。

1.2 药品和试剂 地黄饮子 （方药组成：熟地黄12 g，巴戟天9 g，山茱萸9 g，石斛9 g，肉苁蓉9 g，附子6 g，五味子6 g，官桂6 g，白茯苓6 g，麦门冬6 g，石菖蒲6 g，远志6 g，生姜5片，大枣1枚，薄荷5～7片。购自辽宁医学院附属第一医院药剂科）；DMEM培养基、F12培养基 （GIBCo公司），多聚赖氨酸、胰蛋白酶 （Sigma公司），胎牛血清、马血清 （北京华美生物工程公司）。

1.3 含药血清的制备 将地黄饮子药材浸于10倍量常水中过夜，加热煮沸1 h，药渣再加入8倍量的常水煮沸45 min，将药液浓缩，使其质量浓度为1 g生药/mL，于4℃冰箱保存。Wistar大鼠，体质量 （250±20）g，10只，雌雄各半，晚禁食，灌服药液 （剂量按1 g生药/100 g大鼠），连续3 d，2次/d，于第3天给药后1 h用水合氯醛麻醉动物 （剂量为3.5 mL/kg），从股动脉取血，自然分离血清，56℃水浴中灭活30 min，0.22 μm滤器过滤除菌，分装，－20℃保存备用。设空白组血清制备时灌服生理盐水，余方法同上。

2 实验方法

根据张挺［2］、任历［3］等的方法加以改进，以连二亚硫酸钠Na2S2O4药物制造急性缺氧模型，并以此为基础进行实验。

2.1 药物实验分组 正常对照组：使用正常细胞培养液和空白血清混合培养；损伤对照组：使用含有Na2S2O4的缺氧培养液和空白血清混合培养；药物保护组：使用含有Na2S2O4的缺氧培养液和不同浓度的含药血清混合培养 （含药血清用空白血清稀释成不同比例），具体如下：

药物保护Ⅰ组：药物血清与空白血清比例为1∶3；药物保护Ⅱ组：药物血清与空白血清比例为1∶1；药物保护Ⅲ组：药物血清与空白血清比例为2∶1；药物保护Ⅳ组：药物血清与空白血清比例为3∶1。

2.2 细胞形态学观察 使用HE染色处理后对海马神经细胞突触的生长状态，细胞轮廓，胞体晕光等进行观察。用来对模型的效果进行鉴定，观察在药物保护下细胞的变化。

2.3 乳酸脱氢酶 （LDH）漏出量测定 收集各组细胞培养上清液，经过测定，计算各组脑海马细胞培养上清液中所含LDH漏出量。反映在药物保护作用下神经细胞的变化。

2.4 脑海马神经细胞存活率和细胞活力测定 使用96孔细胞培养板常规培养，施加处理因素，测定570 nm波长处各组各孔的吸光度 （A570）。采用琥珀酸脱氢酶 （SDH）试剂盒，比色法测定线粒体内SDH的含有量，进而反映出细胞的代谢状态以及存活情况。

2.5 超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛 （MDA）测定 通过试剂盒测定SOD和MDA数值变化，观察不同浓度药物对细胞缺氧状态下保护的效果，并对其机制进行初步的探讨。

3 实验结果

3.1 对照组和药物保护组海马神经元细胞形态学变化 损伤对照组：6 h后，海马神经元胞体和突触的变化更为严重，胞膜和突触膜模糊，有胞膜破裂发生，部分细胞死亡，胞内和突触内出现黑色颗粒；12 h后，大部分海马神经元胞膜破裂，神经突触多已断裂、崩解，细胞死亡 （图1）。药物保护组：加入药物后观测，各时间点细胞形态无明显变化，海马神经元胞体透光性强且周围光晕明显，突触粗大、生长良好，由突触相互连成的神经突触网络稠密 （图2）。对比可见，加入药物后能明显改善细胞在缺血缺氧环境中的生活状态，药物对细胞生长有保护和促进作用。

3.2 地黄饮子对缺血缺氧状态下神经细胞LDH漏出量的影响 施加处理因素3 h后，损伤对照组与正常对照组相比较，神经细胞LDH漏出量水平显著升高 （P＜0.01）；在药物保护各组，该指标有改善，随着地黄饮子剂量的变化，各组与损伤组相比，细胞培养上清液中LDH含有量明显下降，药物血清与空白血清比例为2∶1时，地黄饮子对神经细胞保护作用达到最佳效果（见表1）。

图1 损伤对照组海马神经元生长状态 （光镜下）×100Fig.1 The growth of hippocampus neurons in the control group×100

表1 地黄饮子对缺血缺氧损伤脑海马神经细胞LDH漏出量的影响（±s，n=6）Tab.1 Effects of Dihuang Drink on LDH in hippocampus neurons（±s，n=6）

注：损伤组与对照组比较，aP＜0.01；各药物保护组与损伤组比较，bP ＜0.01，F=107.182。

组别 LDH/（U·L－1）正常对照组308.81±15.13损伤对照组 968.58±71.82a地黄饮子药物保护Ⅰ组 560.51±42.34b地黄饮子药物保护Ⅱ组 456.63±32.39b地黄饮子药物保护Ⅲ组 354.24±16.01b地黄饮子药物保护Ⅳ组 577.60±48.17b

3.3 地黄饮子对缺血缺氧神经细胞SDH活力和细胞存活率的影响 施加处理因素3 h后各组细胞的SDH活性测定：损伤组与正常对照组相比，培养神经细胞内SDH酶活性水平显著降低 （P＜0.01）；在地黄饮子药物保护各组，指标均有改善，与损伤组相比，随剂量的变化，SDH活性均明显升高，当含药血清与空白血清比例为2∶1，地黄饮子保护作用最好，并不再随着浓度的变化而增强。另外，损伤组细胞存活率明显低于正常对照组。各药物保护组中，药物保护1组和4组该指标改善不明显，随着药物剂量的改变，与损伤组相比，细胞存活率有提高，当含药血清与空白血清比例为2∶1，保护作用最好 （表2）。

表2 地黄饮子对缺血缺氧神经细胞SDH活力及细胞存活率的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Dihuang Drink on SDH and cell survival rates in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

表2 地黄饮子对缺血缺氧神经细胞SDH活力及细胞存活率的影响（±s，n=10）Tab.2 Effects of Dihuang Drink on SDH and cell survival rates in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与损伤组比较，bP＜0.05；与损伤组比较，cF=199.145。

组别 OD值 细胞存活率/%正常对照组0.851 1±0.051 5 100.00损伤对照组 0.409 5±0.031 0a 48.12±3.65a药物保护Ⅰ组 0.449 8±0.014 9ac 52.79±1.76a药物保护Ⅱ组 0.622 7±0.062 6ac 73.18±7.35b药物保护Ⅲ组 0.647 2±0.023 7ac 76.05±2.78b药物保护Ⅳ组 0.429 4±0.021 6ab 50.46±2.54a

3.4 地黄饮子对缺血缺氧状态下神经细胞丙二醛（MDA）生成的影响 施加处理因素3 h后海马神经细胞MDA含有量：损伤组明显高于正常对照组。药物保护各组，随药物剂量变化，与损伤组相比，MDA含有量明显降低，且药血清与空白血清比例为2∶1时，保护作用最好强，见表3。

3.5 地黄饮子对缺血缺氧状态下神经细胞SOD活力的影响 施加处理因素3 h后海马神经细胞SOD活力：损伤组明显低于正常对照组。在药物保护各组，剂量达到一定浓度 （当含药血清与空白血清比例为1∶1～2∶1）范围，SOD活力明显高于损伤组，见表3。

表3 地黄饮子对缺血缺氧状态下MDA、SOD的影响（±s，n=10）Tab.3 Effects of Dihuang Drink on MDA and SOD in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

表3 地黄饮子对缺血缺氧状态下MDA、SOD的影响（±s，n=10）Tab.3 Effects of Dihuang Drink on MDA and SOD in anoxyaemia neurons（±s，n=10）

注：与损伤组比较，aP＜0.01，F=90.688。

组别 MDA/（nmol·mL－1） SOD（U·mL－1）正常对照组2.966 0±0.903 6 121.652 6±16.144 3损伤保护组 8.229 8±0.548 2 32.346 7±13.918 5药物保护Ⅰ组 5.721 4±0.578 5a 78.112 3±10.281 9a药物保护Ⅱ组 3.910 6±1.039 0a 111.748 1±14.069 7a药物保护Ⅲ组 3.541 0±0.287 9a 110.509 9±16.348 8a药物保护Ⅳ组 7.021 7±0.351 6a 48.909 8±9.304

4 讨论

脑缺血缺氧导致多种病理生理功能改变。其机制涉及自由基损伤、能量耗竭等方面。各因素导致连锁反应使膜通透性增加，组织水肿、细胞结构和功能遭到破坏［4］。细胞结构功能的改变更加重能量代谢障碍，与钙超载及自由基之间相互作用可产生更为广泛的损伤。

中枢神经元含有大量LDH，其化学、生物学性质稳定。通常情况下LDH外漏很少，受损伤时则LDH外漏明显增多。实验显示，缺氧后LDH漏出随缺氧时间的延长逐渐加重，说明海马神经细胞膜通透性因缺氧而发生恶化，地黄饮子保护的神经细胞比较损伤组：缺氧后形态变化轻微，细胞存活数量多，LDH漏出量减少。表明，地黄饮子对神经细胞缺氧损伤有保护作用，当含药血清与空白血清比例为2∶1时作用效果最佳并有剂量依赖趋势。推测该作用可能是地黄饮子通过提高细胞对氧的利用，对缺血缺氧造成的细胞能量代谢降低有拮抗作用，消除了乳酸堆积，保护细胞膜完整性和正常生理功能［5-7］。

地黄饮子由熟地、巴戟天、山茱萸、石斛、肉苁蓉、五味子等组成，具有滋肾阴，补肾阳，化痰开窍的功能。有临床报道表明，地黄饮子治疗脑血管性痴呆、脑萎缩、中风及后遗症、运动神经元病等，对神经系统具有较好的保护作用。应用地黄饮子对改善学习记忆功的研究表明，地黄饮子可明显提高细胞呼吸活性，加上地黄饮子对缺氧损伤神经细胞SDH的作用结果，可推测地黄饮子促进细胞线粒体对氧的利用，促进三羧酸循环，巩固、提高细胞有氧代谢，为细胞提供足够能量，以抵抗能量供给不足带来的影响，最终代谢产物为二氧化碳和水，消除乳酸对细胞的损伤，延长了细胞在缺氧状态下的存活时间［8-11］。

脑缺血缺氧等状态下自由基大量产生，由于防御机制发生障碍或数量关系，不能将自由基及时彻底清除，自由基得以产生损害作用［12-14］，SOD是最主要的自由基清除酶，也是机体阻断自由基病理性连锁反应的防御酶。脂质过氧化终产物为MDA。实验显示，地黄饮子能显著降低缺血后神经细胞MDA含有量，并有剂量依赖性，说明地黄饮子能降低缺血脑细胞脂质过氧化反应程度，间接提示地黄饮子可以降低脑组织氧自由基的水平。与正常组比较损伤组SOD活性显著下降，各地黄饮子组，在一定程度逆转缺血缺氧损伤后SOD活性的下降，维持组织对氧自由基的清除能力，减轻脂质过氧化损伤，保护细胞膜，使LDH漏出量减少，抑制乳酸增加。提高SOD活性，降低氧自由基含有量可能是地黄饮子对脑缺血损伤产生保护作用的机制。

地黄饮子对于保护SOD活力、减少脂质过氧化终产物MDA的生成、提高神经细胞线粒体呼吸能力等作用预示了这种药物有着重要的应用价值，在神经系统缺血-缺氧性疾病的治疗中有广阔的应用前景。

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Protective effect and mechanism of Dihuang Drink on the hypoxic injury to hippocampal neurons

LI Zi-jun， LIU Chun-na*
（Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

AIMTo observe the protective effect and mechanism of Dihuang Drink（Rehmanniae Radix praeparata，Morindae officinalis Radix，Corni Fructus，Dendrobii Caulis，Cistanches Herba，etc.）on the anoxaemia of cultured hippocampal neurons.METHODSCultured hippocampal neurons were divided into three groups：control group，model group and drug-protective group.Hypoxia induced by 1 mol/L Na2S2O4in low sugar solution on hippocampal neurons for 3 h in the model group，while different concentrations of Dihuang Drink were added at the same time in the drug-protective group.Colorimetric method was used to test the concentration of delectate hydrogenase（LDH），and MTT method was applied to observing the hippocampus cell survival.The content of succinic dehydrogenase（SDH）in mitochondria was intended to reflect the protection and effective concentration of Dihuang Drink.Moreover，the changes of malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）were measured in the cultured hippocampal neurons.RESULTSDihuang Drink had protective effect on hippocampal neurons at ratio of the concentration of Dihuang Drink to blank serum（1∶3 to 3∶1）.Decrease in the release of LDH could reduce the damage to cell membrane.The increase in MTT value meaned cell activity was enhanced and cell energy metabolism was improved.Moreover，Dihuang Drink concentration-dependently increased the content of SOD and decreased the MDA（P ＜0.01）in the hypoxic hippocampal neurons.CONCLUSIONDihuang Drink has an obvious protective effect on the hypoxic hippocampal neuron via decreasing free radicals injury.

Dihuang Drink；hippocampal neurons；anoxyaemia；oxygen free radicals

R285.5

A

1001-1528（2012）08-1421-04

2012-03-01

辽宁省教育厅创新团队项目 （LT2010065）；辽宁省自然科学基金项目 （20102139）

李子军 （1963—）男，高级实验师，主要从事中药药理工作。

*通信作者：刘春娜 （1977—），女，副教授，博士，主要从事中药药理工作。Tel：（0416）4673465，Email：springnana@tom.com