督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响①

李兵奎，曾彬，常巍，王达义，郭振鹏，杨棋，刘涛

督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响①

李兵奎1a，曾彬2，常巍1a，王达义1a，郭振鹏1a，杨棋1a，刘涛1b

目的探讨督脉电针治疗对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响。方法利用多中心急性脊髓损伤打击器建立大鼠T11脊髓损伤模型，建模成功后随机分为对照组(A组)和督脉电针组(B组)。脊髓损伤后1周，B组接受督脉电针治疗。两组大鼠于脊髓损伤后1、2、4、8周行BBB后肢运动功能评分，脊髓损伤后2、4、8周行体感诱发电位(SEP)检测，脊髓组织行HE染色与神经丝蛋白(NF200)免疫组化染色。结果SCI后1周，两组大鼠BBB后肢运动功能评分无显著性差异(P＞0.05)；SCI后2、4、8周，B组BBB后肢运动功能评分较A组明显升高(P＜0.01)，SEP潜伏期明显缩短、波幅明显增高(P＜0.01)。HE染色显示损伤区瘢痕组织及空洞形成，B组脊髓空洞比A组小；脊髓组织NF200阳性表达B组各时间点较A组明显增强(P＜0.01)。结论督脉电针治疗可有效促进SCI大鼠神经功能恢复。

脊髓损伤；电针；督脉；体感诱发电位

[本文著录格式]李兵奎，曾彬，常巍，等.督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响[J].中国康复理论与实践,2012, 18(7):619-622.

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是人类致残率最高的疾患之一[1]。脊髓损伤后，脊髓内大量神经元坏死或凋亡，使神经细胞分泌的神经营养因子减少，破坏了支持轴突再生的有利微环境[2]；暴露的髓鞘相关抑制分子及继发的胶质瘢痕、空洞阻碍了轴突的生长和正确连接[3]。这些不可逆的病理生理过程使脊髓损伤修复成为世界难题。电针作为中医传统治疗方法，已引起越来越多研究者的关注。本研究观察督脉电针治疗对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年雌性SPF级SD大鼠40只，体质量200～250 g：湖北医药学院实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(鄂)2011-0008。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》标准[4]。

1.1.2 主要仪器及试剂 脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor M odelⅠ)：美国纽约大学；低频电子脉冲治疗仪(G6805-3型)：上海华宜医用仪器有限公司；生物机能实验系统(BL-420S型)：成都泰盟科技有限公司；生物显微镜(OLYMPUS-BX40)：日本OLYMPUS公司；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件：M edia Cybernetics公司；兔抗神经丝蛋白(Neurofilament 200, NF200)多克隆抗体(bs-0708R)：北京博奥森生物技术有限公司；快捷型酶标羊抗兔IgG抗体(KIT-5005)、DAB显色试剂盒：福州迈新生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓损伤模型的制备 大鼠10%水合氯醛3m l/ kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板上，术区备皮消毒。取后背部长约3 cm切口，逐层切开，切除T11椎板及棘突，显露T11脊髓，暴露3×4mm打击区。将大鼠移入脊髓损伤打击器载物台，钳夹固定打击区上下端椎骨，使打击杆自2.5 cm高度自由落下，撞击脊髓，打击势能为25 g·cm。术后每日常规肌注青霉素+庆大霉素预防感染，共3 d，并予以人工排尿、排便2次/d，直至大鼠排尿反射恢复。

1.2.2 动物分组及干预措施 36只大鼠造模成功。分为对照组(A组)和督脉电针组(B组)，每组18只。SCI后1周，B组进行督脉电针治疗：大鼠清醒状态下固定，直径0.3mm毫针捻针法分别于大椎穴、命门穴缓慢进针，深度达硬膜外，分别与低频电子脉冲治疗仪输出端电极连接，大椎穴接正极，命门穴接负极，疏密波，频率：密波60 Hz、疏波2 Hz，刺激强度以大鼠后肢出现轻微颤动为度，每次20m in，每天1次。

1.2.3 后肢运动功能评定 于SCI后1、2、4、8周分别由两名熟悉评分标准但非本组实验人员的独立观察者根据BBB评分法[5]对大鼠后肢运动功能进行评分，左右侧下肢评分不相同时取平均值，每只大鼠的功能得分取两人评分均值。

1.2.4 体感诱发电位(somatosensory evoked potential, SEP)检测[6]于SCI后2、4、8周，各组随机选取6只大鼠，进行SEP检测：10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板上；取头顶部正中长约1 cm切口，逐层切开，显露颅骨骨缝，以颅骨矢状缝右侧2 cm、冠状缝后侧2 cm处为记录电极定位点；自定位点钻入金属针状记录电极，深度以刚穿透颅骨为限；将记录电极与信号输入端相连，参考电极夹于左侧头皮切口处，接地电极夹于右侧颞部皮下；于大鼠左侧坐骨神经走行处插入2根毫针作为刺激电极，两针相距1 cm，将刺激电极与刺激输出端相连；打开生物机能实验系统，进入“实验项目-中枢神经实验-大脑皮层诱发电位”模块，输出单脉冲刺激，可见大鼠左侧后肢规律性抖动；记录双侧大脑皮层SEP，每侧均记录100次波形后叠加平均，得到最终结果。

1.2.5 脊髓组织病理学检查 SEP检测完毕后，大鼠灌注处死，具体方法如下：大鼠麻醉成功后，仰卧位固定于解剖板上，打开腹腔，显露肝脏，自剑突向两侧依次剪开膈肌，于胸骨两侧“V”字形剪断肋骨，用血管钳夹住剑突向上翻开胸骨并固定，充分显露双肺及心脏；用麻醉穿刺针自心尖部刺入，达主动脉内，固定穿刺针，拔出内芯，穿刺针尾端连接输液器；剪开右心耳，以生理盐水300m l经主动脉灌注，冲出大鼠体内血液，直至肝脏颜色由紫红色变为灰白色，右心耳流出清亮液体；再以4%多聚甲醛PBS溶液250 m l继续灌注，当大鼠四肢僵硬，眼睛发白，肝脏变为土褐色、触之坚韧时，停止灌注。拔出穿刺针，将大鼠置于俯卧位，取出损伤区域脊髓组织经甲醛固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4μm厚切片。常规HE染色，显微镜下观察脊髓组织形态。NF200免疫组化染色(SP法)，显微镜下观察脊髓组织NF200的阳性表达情况；每个标本随机选取2张切片，400×光镜下随机选取3个视野，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量NF200阳性产物的积分光密度值(integral optical density,IOD)，每个标本取2×3个视野的平均值。

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料用(±s)表示，两组间比较采用t检验。若方差不齐或数据资料不服从正态分布，则采用秩和检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况 大鼠于术后2～4 h清醒。精神萎靡，行动迟缓，双后肢拖行，无活动迹象，大小便障碍，出现截瘫表现。SCI后1周内，10只大鼠出现血尿，经抗感染治疗后多数好转，2只死亡。SCI后2周内，大鼠进食、进水量减少，体重逐渐下降，2只大鼠因麻痹性肠梗阻死亡。2周后，大鼠基本恢复排尿反射，进食、进水量恢复正常，体重逐渐增加。

2.2 后肢运动功能评分 SCI后两组大鼠后肢运动功能均即刻丧失，BBB评分均为0分。SCI后1周，两组大鼠BBB评分无显著性差异(P＞0.05)。SCI后2、4、8周，与A组比较，B组BBB评分明显升高(P＜0.01)。见表1。

表1 SCI后不同时间点两组大鼠BBB后肢运动功能评分

2.3 SEP检测 SCI后2、4、8周，与A组比较，B组SEP潜伏期明显缩短、波幅明显增高(P＜0.01)。见表2、表3。

2.4 病理学检查

2.4.1 大体观察 两组大鼠脊髓标本均可见损伤处直径明显变细，局部颜色加深，呈淡黄色。两组间无明显差别。

2.4.2 HE染色 两组HE染色均可见损伤区组织结构紊乱，尼氏体消失，细胞肿胀、空泡变性，瘢痕组织及空洞形成。其中A组脊髓空洞较大，B组脊髓空洞较小(图1)。

2.4.3 NF200免疫组化染色 两组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达，主要分布于损伤区周围，呈棕黄色细丝状。与A组比较，B组各时间点NF200阳性表达均明显增强(P＜0.01)。见表4。

表2 SCI后不同时间点两组大鼠SEP潜伏期(ms)

表3 SCI后不同时间点两组大鼠SEP波幅(μV)

表4 SCI后不同时间点两组大鼠NF200表达(IOD值)

图1 SCI后8周两组大鼠脊髓组织(HE染色，200×)

3 讨论

动物脊髓损伤后神经功能评定方法主要有运动功能评价、神经电生理评价、组织形态学评价，实际应用时应将三者结合。

BBB法是目前许多学者较为推崇的一种运动功能评价方法，由Basso等[5]于1995年提出，用于评估大鼠运动功能。

神经电生理评价是一种比较客观的评定方法，其中体感诱发电位是一项敏感的神经电生理指标。国内外研究表明，SEP与脊髓损伤程度具有较好的相关性，其变化可以反映脊髓传导功能受损的程度[7]。

NF是构成神经元胞体和轴突的细胞骨架蛋白，是神经元的特异性标志之一[8]。正常情况下，NF200仅存在于轴突内，胞体中含量很少或没有；脊髓损伤后，NF200积存于神经元胞体内，免疫组织化学染色可使胞浆着色[9]，呈现为阳性表达。NF200阳性表达越强提示再生的神经纤维越多，在形态学上反映神经生长的情况[10]。本实验结果显示，督脉电针治疗能提高NF200阳性表达，促进SCI大鼠损伤区神经再生。

综合BBB评分、SEP检测、HE染色和NF200免疫组化染色结果，督脉电针治疗对SCI大鼠神经功能的恢复有肯定的促进作用。

中医理论认为，督脉为“阳脉之海”，具有总督一身之阳经、调节阳经经气的作用。脊髓损伤所致截瘫为督脉受损，气滞血淤，经脉不通，筋脉肌肉失去气血濡养而导致痿废不用。针刺督脉可通调督脉阳气，直达病所，使肾强髓满而达治疗目的。

督脉电针既能调节经气、疏通气血，同时又是一种脉冲电场，具有针刺和电场的双重作用。其促进SCI修复的作用机制可能为：电针能改善局部血液循环，减轻脊髓水肿[11]；抑制氧自由基和脂质过氧化损伤[12]；减少兴奋性氨基酸毒性，减少神经元内的钙离子超载毒性[13]；抑制神经细胞凋亡基因表达[14]；促进神经营养因子合成[15-16]；减少神经抑制因子的形成，改善神经再生微环境等。

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Effects of Du M eridian Electroacupuncture on Neurological Function of Rats after Spinal Cord In jury

LI Bing-kui,ZENG Bin, CHANGWei,etal.DepartmentofSpinal Surgery,Taihe Hospital,HubeiUniversity ofMedicine,Shiyan 442000,Hubei,China

Ob jectiveTo investigate the effect of Dumeridian electroacupuncture on the neurological function of rats after spinal cord injury(SCI).M ethodsThe SCImodel of ratswas induced w ith MASCIS Impactor at the level of T11segmentand were equally divided into control group(group A)and Dumeridian electroacupuncture group(group B).Group B received electroacupuncture once a day 1 week after SCI.They were assessed w ith Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)score 1,2,4,8 weeks after SCI,somatosensory evoked potential(SEP)and spinal cord histopathological exam ination 2,4,8 weeks after SCI.Resu ltsThe difference of BBB score was not significant between the groups 1 week after SCI(P＞0.05),but improvedmore in group B than in group A 2,4,8 weeks after SCI(P＜0.01),aswell as the latency and wave amplitude of SEP(P＜0.01).There were scar tissue and syringomyelia in injured spinal cord,and the size of syringomyeliawas larger in group A than in group B.Neurofilament 200(NF200)expressed 2,4,8 weeks after SCI,and wasmore in group B than in group A(P＜0.01).ConclusionDumeridian electroacupuncture can promote the recovery of neurological function in ratsafter spinal cord injury.

spinal cord injury;electroacupuncture;Dumeridian;somatosensory evoked potential

R651.2

A

1006-9771(2012)07-0619-04

2012-04-27)

湖北省教育厅科学技术研究计划重点项目(D20082403)。

1.湖北医药学院附属太和医院，a.脊柱外科；b.病理科，湖北十堰市442000；2.湖北医药学院附属东风公司总医院内科，湖北十堰市442000。作者简介：李兵奎(1979-)，男，湖北黄冈市人，硕士，主治医师，主要研究方向：脊柱外科。通讯作者：常巍。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.07.007