晚期NSCLC组织中RRM1表达变化及意义

(苏州大学附属第四医院，江苏无锡214062)

核糖核苷酸还原酶M1(RRM1)高表达是吉西他滨耐药的主要机制之一［1］，因此检测癌组织中RRM1的表达情况可用以判定吉西他滨治疗的效果。2008年2月～2011年5月，观察了晚期NSCLC组织中RRM1蛋白及其mRNA的表达变化，为通过RRM1表达水平指导临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年2月～2010年5月我院收治的NSCLC患者54例，男32例、女22例，年龄49～83岁;有吸烟史者35例。患者既往未接受过任何抗肿瘤治疗，且无法手术切除;均经支气管镜下活检或穿刺活检确诊，其中鳞癌18例，腺癌33例，其他3例;临床分期ⅢB期25例，Ⅳ期29例。

1.2 化疗及疗效判定方法 患者均给予GP方案化疗。第1、8天静注吉西他滨1 000 mg/m2，第1天静注顺铂75 mg/m2，28 d为1个周期。治疗1个周期后评价化疗效果，按WHO与国际抗癌联盟标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)与疾病进展(PD)。有效为CR+PR+SD，有效者应1个月后再次检查确认。生存期为患者治疗开始至死亡或失访的时间。

1.3 RRM1 mRNA及蛋白检测方法

1.3.1 RRM1蛋白检测方法 收集活检标本，4%甲醛固定，常规包埋制片;采用免疫组化(IHC)法检测，按说明书操作。RRM1阳性细胞为胞质中出现棕黄色颗粒，阳性细胞占总细胞数的百分比≥5%为RRM1阳性，＜5%为RRMl阴性。

1.3.2 RRM1 mRNA检测方法 采用 PCR。活检组织离体后液氮保存，研碎后按Trizol RNA抽提纯化说明书的方法抽提组织总RNA。将提取的组织总RNA，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H－)kit说明书操作逆转录呈 cDNA。荧光定量PCR仪为购至ABI公司的7300，内参基因是β-actin，引物和探针由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系共20μL:2×realtime PCR buffer 10 μL，dNTP 1 μL，前向引物、后向引物、ROX 各 0.4 μL，模板2μL，加水补足20μL。反应条件:50℃ 2 min，95℃ 变性 10 min，然后95℃ 变性 20 s，60℃退火并延伸1 min为1个循环，40个循环。RRM1的Ct值与β-actin的Ct值之差，即ΔCt，以中位ΔCt为标准，ΔCt值≥中位值为低表达，＜中位值为高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较采用χ2检验及t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织中RRM1蛋白及mRNA表达 本组54例晚期NSCLC患者中，RRM1蛋白阳性22例(40.7%)，阴性32例;RRM1 mRNA高表达27例(50.0%)，低表达27 例。二者比较，P ＞0.05。

2.2 NSCLC组织中 RRM1 mRNA及蛋白表达与GP方案疗效、生存时间的关系 RRM1蛋白阴性者化疗有效率为46.9%，高于阳性者的27.3%(P＜0.05)。RRM1 mRNA低表达者的化疗有效率为51.9%，高于高表达者的25.9%，但是差异不具有统计学差异(P＞0.05)。见表1。

表1 NSCLC组织中RRM 1 mRNA及蛋白表达与GP方案疗效、患者生存时间的关系

3 讨论

吉西他滨是目前NSCLC的主要化疗药物，它是脱氧胞苷的结构类似物，能够被脱氧核苷激酶和单磷酸脱氧核苷激酶磷酸化成二磷酸脱氧胞嘧啶的结构类似物，与核糖核酸还原酶(RNR)结合，抑制RNR的活性，从而抑制DNA的合成，是目前主要的RNR抑制剂［1］。RRM1是 RNR的重要亚基之一，除参与脱氧核苷酸的合成外，在DNA的修复中也扮演重要的角色。目前大多数学者认为，DNA的修复机制在肿瘤的发生和发展及治疗中似乎扮演着双面角色。一方面，DNA合成修复机制差的细胞容易发生癌变，但另一方面，如果肿瘤细胞中DNA合成修复过强恰恰造成对化疗药物耐药［2，3］。所以，多数研究认为，肿瘤组织中RRM1低表达者较易从吉西他滨相关的治疗方案中受益，使RRM1检测成为肺癌个体化治疗研究的热点［4～10］。

本研究应用PCR和IHC的方法，从mRNA和蛋白水平分别检测了同一组标本中的RRM1表达情况，并分析了其与吉西他滨治疗效果之间的关系。结果显示，IHC法检测的RRM1蛋白阴性者的疾病缓解率、1年生存率、中位生存期均高于阳性者(P均 ＜0.05)，与 Yang等的报道结果一致［5］。PCR 检测的RRM1基因低表达者化疗有效率虽高于高表达者但P＞0.05，RRM1基因低表达者的1年生存率、中位生存期均高于高表达者(P均＜0.05)，与王临润等的报道结果相似［6］。

我们进一步比较了两种方法之间的差异，两者的一致性为75.9%;在阴性组中，PCR低表达者中的有效率(51.9%)高于IHC检测阴性者(46.9%)，但受益率(81.5%)低于IHC检测阴性者(87.5%)，且PCR法无统计学意义。PCR检测以中位值为判断标准，将研究对象分为均等的两组，即阴性率和阳性率永远为50%;IHC在确定了阳性标准后将研究对象分为两组。就本研究来看，IHC检测阴性者纳入了更多的患者，阴性率为59.3%。通过分析我们发现，IHC检测确定为阴性的患者中有9例PCR确定为高表达，而PCR确定为低表达者中有4例IHC检测确定为阳性。进一步分析这13例标本，我们发现有8例误判标本其表达值临近判断标准;但是，还有5例为IHC检测阴性、PCR检测高表达，PCR表达值远离判断标准。结合HE切片，我们发现这5例标本中4例炎症较为严重，伴随大量炎细胞浸润，1例伴有较严重的出血。所以我们推断，这5例标本PCR和IHC结果出现较大偏差的原因可能与大量炎细胞浸润有关。可见IHC在一定程度上能够更好的避免假阳性和假阴性，要优于PCR法，能让更多NSCLC患者受益于吉西他滨治疗。当然，这一结论还需要更多的实验在更大的标本上去进行进一步的验证。

［1］Lars Petter J，Pascal S.The ribonucleotide reductase large subunit(RRM1)as a predictive factor in patientswith cancer［J］.Lancet Oncology，2011，12(7):693-702.

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［3］Simon GR，Sharma S，Cantor A，et al.ERCC1 expression is a predictor of survival in resected patients with non-small cell lung cancer［J］.Chest，2005，127(3):978-983.

［4］WeiyiG，Xinmin Z，JinfengW，etal.RRM1 expression and clinical outcome of gemcitabine-containing chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer:A meta-analysis［J］.Lung Cancer，2012，75(3):374-380.

［5］杨志坚，刘德森，陈发龙，等.肺癌组织中RRM1表达对预测GP化疗方案疗效的作用［J］.中华肿瘤防治杂志，2009，1(2):124-126.

［6］王临润张国兵陈建 等.RRM1和BRCA1的表达与吉西他滨联合铂类治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究［J］.中国药学杂志，2010，20(3):1577-1580.

［7］陈建，李敏伟，张国兵，等.SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRMl和ERCC1及BRCAl基因表达水平［J］.浙江大学学报(医学版)，2010，39(6):628-635.

［8］Postel-Vinay S，Vanhecke E，Olaussen KA，etal.The potential of exploiting DNA-repair defects for optimizing lung cancer treatment［J］.Nat Rev Clin Oncol，2012，9(3):144-155.

［9］Zhang L，Yang H，Xu J.Gene expression significance in personalized medicine of non-small-cell lung cancer and gene expression analyzing platforms［J］.Curr Drug Metab，12(5):455-459.

［10］Andrews TD，Baird JW，Wallace WA，et al.Routinely obtained diagnosticmaterial as a source of RNA for personalized medicine in lung cancer patients［J］.JThorac Oncol，6(5):884-888.