熊果酸纳米脂质体微粒对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及机制探讨

(安徽医科大学第三附属医院，合肥230061)

熊果酸(UA)广泛存在于天然植物和中草药中，具有抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能［1～4］。熊果酸纳米脂质体微粒(UA-PL-NP)具有溶解性高、吸收性强、生物利用度高及靶向治疗特点［5］，提高了UA对肿瘤细胞的杀伤作用［6］。2011年4～11月，我们观察了UA-PL-NP对人胃癌细胞株SGC-7901增殖活性的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SGC-7901由安徽医科大学核医学教研室提供;UA-PL-NP(Sigma公司)用生理盐水溶解，储备浓度为20 mg/L;HG-DMEM，胎牛血清，胰蛋白酶;MTT，瑞姬染液，Caspase-3蛋白抗体及S-P免疫组化试剂盒;CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪(ELX-800);Eppendorf 5417r台式高速冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 UA-PL-NP对SGC-7901细胞增殖影响的观察 调整细胞悬液浓度为5.0×104/mL，200μL/孔接种96孔板。对照组不加药物，观察组分别加入0.01、0.1、1.0、10.0 mg/L 的 UA-PL-NP。每组及各浓度亚组的UA-PL-NP，均设5个复孔。分别于培养24、48、72 h后，采用 MTT法观察细胞增殖情况，按说明书操作，在酶标仪570 nm波长下检测各孔的吸光度(A)值。各组实验重复3次，取均值。细胞增殖抑制率=(对照组A值－观察组A值)/对照组A值×100%;用直线回归法测定中效浓度，即IC50。

1.2.2 UA-PL-NP对SGC-7901细胞凋亡影响的观察 调整细胞悬液浓度为5.0×104/mL，以每孔2 mL接种预置盖玻片的24孔板。对照组常规培养，观察组每孔加入3.73 mg/L的UA-PL-NP;培养72 h后，PBS洗涤3次;4%多聚甲醛室温固定20 min后，再用PBS洗涤3次;取出盖玻片用瑞氏染色法染色，倒置显微镜观察细胞形态。

1.2.3 UA-PL-NP 对SGC-7901细胞中Caspase-3蛋白表达影响的观察 分组及处理同1.2.2，常规SP法免疫化学染色，DAB显色，苏木精复染后光镜下观察。结果分析:排除爬片边缘细胞，低倍镜下随机选取1个细胞均匀分布的视野，中倍镜下每个视野随机选50个细胞。Caspase-3蛋白阳性细胞为胞质着棕黄色，无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3;Pi表示评分为i的比例)计算细胞HSCORE得分，以此表示Caspase-3蛋白的表达量。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。实验数据以±s表示，数据处理行t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UA-PL-NP对SGC-7901细胞增殖的影响 结果显示，UA-PL-NP对SGC-7901细胞具有增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性(P均＜0.05)。见表1。UA-PL-NP 作用 24、48、72 h 的 IC50值分别为8.06、5.17、3.73 mg/L。

表1 UA-PL-NP对SGC-7901细胞增殖的影响(±s)

表1 UA-PL-NP对SGC-7901细胞增殖的影响(±s)

UA-PL-NP(mg/L)增殖抑制率(%)24 h 48 h 72 h 0.01 3.25 ±0.79* 5.71 ±0.87* 25.32 ±2.77*0.10 13.46 ±1.74* 19.11 ±2.13* 42.94 ±3.56*1.00 23.45 ±2.52* 42.62 ±3.63* 61.70 ±4.47*10.00 49.83 ±4.02* 68.54 ±4.55* 84.74 ±5.24*

2.2 UA-PL-NP对SGC-7901细胞凋亡的影响 倒置显微镜下观察，对照组细胞生长旺盛，呈多边形，可见多核细胞和巨核细胞，胞膜光滑，胞质浅蓝紫色，胞核紫红色，核仁深紫色。UA-PL-NP作用后细胞生长受抑，贴壁细胞数明显减少，结构模糊，细胞皱缩，密度增高，染色质聚集，核固缩，细胞边缘胞质突起呈芽胞状，从细胞主体上脱离，有的含有染色质团块，形成典型的凋亡小体。

2.3 UA-PL-NP对SGC-7901细胞中Caspase-3蛋白表达的影响 对照组和观察组Caspase-3蛋白阳性表达细胞的HSCORE得分分别为(2.133±0.149)、(3.307 ±0.069)分，两组比较，P ＜0.05。

3 讨论

研究［7～10］已证实，UA 可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，并且其机制可能与下调COX-2、降低Bcl-2/Bax比值、激活Caspase-3蛋白有关，也可能与抑制血管生成有关。但由于UA本身生物利用度低的缺陷，限制了其抗肿瘤等生物学效应的发挥。UA-PL-NP的相关研究表明，其对其他恶性肿瘤细胞也有生长抑制作用。孙旭芳等［10］研究发现，UAPL-NP对小鼠黑色素瘤B16细胞的增殖有明显抑制作用，并呈浓度和时间依赖性，UA-PL-NP作用24 h的IC50值为7.68 mg/L;另外，其能促进瘤细胞的凋亡，从而抑制B16小鼠黑色素瘤细胞的增殖;降低MMP-9蛋白的表达，有抑制肿瘤侵袭和转移的作用。与本实验结果相似。

本实验免疫细胞化学检测显示，UA-PL-NP可上调 SGC-7901细胞 Caspase-3蛋白的表达。Caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡的过程中起着关键性的作用。根据Caspase在级联反应上下游的位置及功能的不同，分为凋亡始动子、凋亡效应子和炎症组3大类。Caspase-3属于凋亡效应子，能被上游的始动子激活，激活后作用于特异性底物使细胞发生生化及形态学改变，导致细胞凋亡。Caspase-3在细胞凋亡中起关键作用［11］，一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免，因而Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”。Caspase-3活化后大致通过酶解灭活凋亡抑制物、酶解细胞外基质及骨架蛋白和裂解DNA修复相关分子3种机制使细胞解体［12］。另外 Donepudi等［13］发现，Caspase-3 可导致细胞凋亡最终步骤的执行。因此，UA-PL-NP可能通过上调Caspase-3表达，促进SGC-7901细胞凋亡，有望作为一种新型抗肿瘤药应用于临床。

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