HPLC-MSMS法快速鉴定Z/E马来酸桂哌奇特异构体

陈俊苗， 朱登勇， 王少敏， 张 凯， 李翠萍， 刘宏民

(1.郑州大学 化学与分子工程学院 河南 郑州 450052；2.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001)

0 引言

随着药物构效关系研究的深入，药物异构体的分离分析日益被人们重视.高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MSMS)集合液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度、高分辨能力于一体，是进行同分异构体检查和药物降解产物分析鉴定的强有力分析工具之一[1-3].马来酸桂哌奇特(cinepazide maleate)是一种新型的治疗心脑血管疾病的药物(结构式见图1(a))，是一种钙离子通道阻滞剂，同时具有对腺苷、cAMP增效的生物学作用[4].在马来酸桂哌奇特的合成及储存过程中，总伴随有部分Z型异构体杂质(图1(b))的生成[5]，但到目前为止分离检测其Z/E型异构体的报道很少，且检出时间较长[6].由于Z型异构体价格昂贵且不易购得，并且对照两个分离峰的紫外色谱图也不足确证它们为一组Z/E异构体.而采用HPLC-MSMS技术，通过对其E型主成分及其Z型异构体杂质的色谱和质谱分析，可以在无对照品的情况下，对杂质进行快速确认，并确保方法的可靠性.

图1 E型马来酸桂哌奇特主成分(a)及Z型异构体杂质(b)的结构式Fig.1 Structures of E cinepazide maleate(a) and its Z isomer impurity (b)

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Micromass Q-Tof MicroTM高分辨质谱仪(美国Waters公司)；Alliance HPLC 系统(美国Waters公司)：(1) 2695分离单元;(2) 2996光电二极管阵列检测器，Waters MasslynxTM4.0软件系统.马来酸桂哌奇特原料药及E型、Z型对照品(郑州大学新药研发中心提供).乙腈为色谱纯，乙酸铵、乙酸为分析纯，18.2 MΩ超纯水.

1.2 液相色谱/质谱条件

Spherisorb C18柱(5 μm, 4.6 mm×200 mm) (天津市兰博实验仪器设备有限公司)；流动相：乙腈/乙酸铵缓冲溶液(称取无水乙酸铵0.70 g和冰乙酸0.15 g，加水至1 L，摇匀，pH=4.0) (20∶80, V /V );进样体积为10 μL；柱温为30 ℃；流速为1 mL /min (柱后分流80%)；检测波长254 nm.

电喷雾离子源(ESI)；正离子模式；毛细管电压为3 000 V；锥孔电压为30 V；源温为80 ℃；干燥气温度为180 ℃；碰撞活化裂解(CAD)电压为17 V；碰撞气为Ar；扫描范围为m/z50～600.

1.3 测试溶液的制备

马来酸桂哌奇特原料药首先在紫外灯下照射40 h，然后精确称取1 mg用100 mL流动相定容后作为供试品溶液.

2 结果与讨论

取1.3节制备的供试液按1.2节条件进行HPLC-MSMS分析，通过对样品进行全扫描获得样品的总离子流图(TIC)及提取离子流图(EIC)(图2).

图2 E型桂哌奇特(Ⅱ)及其Z型异构体(Ⅰ)的提取离子流图(A)和总离子流图(B)，Z型异构体中m/z 418的二级质谱(C)和E型桂哌奇特中m/z 418的二级质谱(D)Fig.2 The corresponding extract ion chromatogram(A) and total ion chromatogram(B) of E cinepazide maleate( Ⅱ) and Z cinepazide maleate( Ⅰ )，MS/MS spectra of m/z 418 of Z cinepazide maleate in raw drugmaterial (C) and m / z 418 of E cinepazide maleate (D)

从供试品溶液总离子流图中提取m/z418离子得到保留时间分别为4.68 min和5.82 min的两个谱峰.分别对其积分处理发现它们的准分子离子峰分别为m/z418.234 3和m/z418.234 0 (C22H32N3O5)，表明两者为桂哌奇特同分异构体.采用标样对比法对E型桂哌奇特主成分进行确认，可知图2(A)和(B)中5.82 min处的谱峰为E型桂哌奇特(主成分).为进一步获得异构体的结构信息，选择主成分和异构体杂质产生的准分子离子m/z418进行碰撞活化分解(CAD)得到结果如图2(C)和(D).由图可见：在相同质谱条件下(注：裂解电压为17 V)，两者产生的主要碎片均有m/z319.2，m/z221.1，m/z198.2，m/z99.1；E型桂哌奇特主成分和Z型杂质裂解峰中m/z99.1和m/z319.2的碎片丰度基本一致，而m/z198.2和m/z221.1的相对丰度却差异很大:虽然杂质和主成分的MSMS质谱图中碎片峰m/z221.1均为基峰，但杂质中丰度为96%的碎片峰m/z198.2在主成分谱图中仅为53%.推测是因为E型桂哌奇特中双键一端羰基的氧原子和双键另一端的氢原子在双键的同侧易形成分子内氢键(裂解途径见图3)，形成一个五元环过渡态从而使主成分中m/z221.1碎片离子较稳定，以致其相对丰度可达到碎片离子m/z198.2的2倍，而Z型杂质中双键一端的羰基和另一端的氢原子处于反位不易形成这种过渡态使得两个碎片的离子稳定性相当，因此两碎片的丰度也相近.采用标样对比法对Z型杂质进行确认也与此结果相吻合，从而证实了本文的推断.

图3 E型桂哌奇特的裂解过程Fig.3 Cleavage processes of E cinepazide

3 结论

研究结果表明，E型桂哌奇特主成分及其Z型异构体杂质由于空间结构的不同，导致其裂解方式和二级质谱图也不同，可据此将两者加以区分.应用所建立的HPLC-MSMS法能使Z/E马来酸桂哌奇特异构体在没有标样的情况下快速准确地分离和鉴定.

参考文献：

[1] Ermer J, Vogel M. Applications of hyphenated LC-MS techniques in pharmaceutical analysis[J].Biomed Chromatogr, 2000, 14 (6): 373-383.

[2] Wang S M, Bu S S, Liu H M, et al. Separation and characterization of clindamycin phosphate and related impurities in injection by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(6): 899-906.

[3] 苏永恒，张榕杰，冶保献. 固相萃取-超高效液相色谱-质谱法测定蔬菜、水果中多菌灵[J]. 郑州大学学报：医学版，2010，45(3)：490-493.

[4] 张晓霞，韩培红. 马来酸桂哌奇特的药理作用及临床应用研究[J]. 中国药房，2007，18(26)：2060-2062.

[5] 刘华祥. 马来酸桂哌齐特的制备及其光致顺反异构体研究[D]. 大连:大连理工大学, 2009.

[6] 许晋星. RP-HPLC法测定马来酸桂哌齐特片中有关物质的含量[J]. 中国药房，2009，20(1)：59-60.