IL-8基因多态性对慢性HBV感染者血清IL-8水平的影响

张笑添， 任海兰 (山西医科大学汾阳学院生物化学教研室， 汾阳 0300;山西省汾阳医院肾内科)

慢性HBV感染是严重威胁我国人民健康的疾病之一，近年来研究发现，机体接触HBV后，细胞因子在宿主清除病毒的免疫应答中发挥了重要作用，但同时也可导致感染肝细胞的损伤［1］。为了进一步了解慢性HBV感染的病因及发病机制，我们检测了60例慢性HBV感染者和60例健康人群的IL-8－251A/T基因多态性，并测定其血清IL-8水平，以探讨IL-8基因多态性对血清IL-8水平的影响及其与慢性HBV感染的关系。

1 对象方法

1.1 对象 选择2009－10～2010－05山西省汾阳医院就诊的慢性HBV感染者60例，其中男32例，女28例，年龄(41.47±13.32)岁。临床诊断均符合2005年中华医学会肝病与感染病学分会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准［2］。同时选择健康人群60例作为对照组，其中男26例，女14例，年龄(41.65±13.09)岁。本研究已通过医院伦理委员会批准。患者也已经知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清IL-8水平测定 采用ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)检测所有标本血清中IL-8的水平，实验步骤严格按照试剂盒说明操作。

1.2.2 IL-8基因多态性检测 ①抽取研究对象空腹静脉血3－5 ml，用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术公司)抽提DNA，－20℃冻存待检。②使用Primer 5.0软件设计，上游引物:5'－AATGCCTTGCTCCAACTGC－3';下游引物:5'－AAGCTTGTGTGCTCTGCTGTCTCT－3'(上海生工生物技术有限公司合成)。③PCR扩增体系为25 μl，其中模板 DNA 2 μl，上下游引物各 20 pmol，2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μl(北京天根生物技术公司)其余用水补足。扩增条件为:95℃预变性5 min;95℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30 次循环;最后72 ℃延伸8 min。④PCR酶切产物分析，取PCR扩增产物10 μl，限制性内切酶MunⅠ(大连宝生物公司)10 U，0.1%BSA Buffer 2 μl，10 × M buffer 2 μl，其余用水补足，混匀后置37℃酶切过夜。⑤酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，100 V，50 min，使用凝胶成像仪观察拍照。⑥结果判断，IL-8－251A/T位点为AA基因型出现529 bp和275 bp两条区带，AT基因型则出现804 bp，529 bp和275 bp三条区带，TT基因型出现804 bp一条区带，见图1。

图1 IL-8－251A/T位点基因多态性的基因型分析Fig 1 Analysis of genotype of IL-8－251A/T gene polymorphism

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0软件包分析。按Hardy-Weiberg平衡法检测样本的群体代表性。组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，不同基因型间血清IL-8水平比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-8－251A/T位点基因型频率分布 结果显示，IL-8－251A/T多态性位点各基因型频率和等位基因频率在慢性HBV感染组和对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05，见表1)。

2.2 IL-8－251A/T位点不同基因型对血清IL-8水平的影响 基因型为AA型、TA型的慢性HBV感染者其血清IL-8水平显著高于基因型为TT型的慢性HBV感染者(P＜0.01)和对照组所有基因型(P＜0.01)，见表2。

表1 两组研究对象IL-8－251A/T基因型分布及等位基因频率比较 例(%)Tab 1 Comparison of IL-8－251A/T genotype distribution and allele frequency between two groups cases(%)

表2 慢性HBV感染者和健康人不同基因型血清IL-8水平比较(±s，pg/ml)Tab 2 The serum IL-8 level in different genotypes of patients with chronic HBV and healthy controls(±s，pg/ml)

表2 慢性HBV感染者和健康人不同基因型血清IL-8水平比较(±s，pg/ml)Tab 2 The serum IL-8 level in different genotypes of patients with chronic HBV and healthy controls(±s，pg/ml)

与同组TT基因型及对照组所有基因型相比，*P＜0.01

IL-8基因型24 42.33 ±3.28 12 58.21 ±16.04 TA 型 23 42.32 ±2.85 26 98.47 ±30.06*AA 型 13 50.26 ±4.81 22 122.47 ±30.76 IL-8 TT型对照组n IL-8病例组n*

3 讨论

机体感染HBV后，HBxAg能诱导IL-8的表达［3］，而使得血清中的IL-8的水平增加，并且在慢性活动性HBV感染者肝组织中IL-8的表达也高于正常组织。而细胞因子的水平与其基因多态性有关，不同的基因型有可能产生不同的蛋白或者改变转录效率，从而影响疾病的易感性及严重性。Hull等［4］提出IL-8基因启动子区域某些位点的单核苷酸多态性与IL-8基因的转录活性及血清中IL-8的水平有关系，结果显示－251A等位基因IL-8蛋白表达量较－251T等位基因高。同样Taguchi等［5］和Hull等［6］也有类似的发现。但也有相反的结论，Lee等［7］把含A或T等位基因的IL-8启动子克隆在pGL3质粒上，观察IL-8启动子控制荧光素酶表达的强度，结果显示含有T等位基因的荧光素酶表达强度是含A等位基因的2－5倍，从而证明－251T等位基因转录活性高于－251A等位基因。可见，不同的人种、不同的地域、不同的病例来源都会导致研究结果的不一致。

在本课题研究中，我们采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检测慢性HBV感染者及正常对照组IL-8－251A/T基因多态性，对IL-8基因多态性进行了初步的研究。结果显示，当IL-8－251A/T位点为A时，血清IL-8水平较高，而当IL-8－251A/T位点为T时，血清IL-8水平较低。此结果与 Taguchi等［5］和 Hull等［6］的文献报道相一致。这一结果提示IL-8－251A/T基因多态性与血清IL-8水平存在密切关系。而较高的血清IL-8蛋白水平更能使慢性HBV感染者其肝脏炎症细胞浸润更加严重，炎性介质释放更多，炎症反应和肝细胞的损害更重，因而基因型为AA型的HBV感染者更容易发展为慢性肝炎。提示IL-8可能直接参与了病毒性肝炎患者肝脏病理损害的发生和发展，因而应用IL-8拮抗物治疗病毒性肝炎，有望为病毒性肝炎的治疗另辟新径。

而有关基因的多态性可能有更重要的生物学功能，他能够在转录水平上对细胞因子的产生发挥作用，并影响到慢性HBV感染的易感性、疾病的严重程度甚至患者的预后。对基因多态性的检测可能会成为慢性HBV感染临床指导治疗和分辨高危人群重要的评估指标。通过对基因的多态性的研究可能会改变我们目前的治疗策略，在筛选高危人群，通过基因的调控和干预预测和治疗慢性HBV感染等方面有良好的前景。

但本次研究IL-8基因多态性的分析时仅在小样本中作了初步尝试，还需要进一步在更大的独立患者样本及家系中进行群体遗传学研究，谨慎的重复性试验来进一步研究IL-8基因多态性与慢性HBV感染结局的相关性。

［1］ Wang FS.Current status and prospects of studies on human genetic alleles associated with hepatitis B virus infection［J］.World J Gastroenterol，2003，9(4):641 － 644.

［2］ 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南［J］.中华肝脏病杂，2005，12(3):881 －891.

［3］ Tilg H，Kaser A，Moschen AR.How to modulate inflammatory cytokines in liver diseases［J］.Liver Int，2006，26(9):1029 －1039.

［4］ Hull J，Thomson A，Kwiatkowski D，et al.Association of respiratory syncytial virus bronchiolitis with the interleukin-8 gene region in UK families［J］.Thorax，2000，55(12):1023 － 1027.

［5］ Taguchi A，Ohmiya N，Shirai K，et al.Interleukin-8 promoter polymorphism increases the risk of atrophic gastritis and gastric cancer in Japan［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14:2487 －2493.

［6］ Hull J，AckermanH，Isles K，et al.Unusual haplotypic structure of IL8，a susceptibility locus for a common respiratory virus［J］.Am J Hum Genet，2001，69:413 － 419.

［7］ Lee WP，Tai DI，Lan KH，et al.The-251T allele of the interleukin-8 promoter is associated with increased risk of gastric carcinoma featuring diffuse-type histopathology in Chinese population［J］.Clin Cancer Res，2005，11:6431 －6441.