激光共聚焦显微镜观察不同光照模式对复合树脂充填体微渗漏的影响

赵梦明，马会强，刘大勇，贾 智

(天津医科大学口腔医院牙体牙髓科，天津 300070)

龋病是在多种因素作用下，牙体硬组织发生的一种慢性进行性破坏的感染性疾病，是目前发病率最高的口腔疾病之一。牙体硬组织的新陈代谢很弱，釉质内没有任何基于细胞活动的修复功能，一旦遭到破坏，必须用人工材料进行修复。目前临床上在进行充填治疗时主要选用光固化复合树脂。尽管树脂材料在不断改进，材料的硬度、色泽等都已经取得了很大的进步，但是由于固化收缩引起的微渗漏一直没有得到很好的改善［1－2］，进而引起修复体破坏、牙釉质微裂、微渗漏、继发龋、术后敏感等并发症［3－5］。影响微渗漏的因素有很多［6－8］，主要有树脂种类、粘结剂类型以及光固化方式、时间、角度等。复合树脂的固化模式有:弱光引导、间歇光照和高强度光照等3种。弱光引导法是先用低强度光引发聚合反应，再用高强度光照射固化;间歇光照技术采用恒定光强，短暂光照之后短暂停歇，循环数次完成固化。本实验拟采用激光共聚焦显微镜观察比较上述3种不同固化模式下，固化后的复合树脂与牙体组织之间形成的微渗漏差别。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

Adper single Bond 2全酸蚀系统、FiltekTMZ350复合树脂(3M公司，美国);LED光固化灯(belmont治疗椅自带，日本);Isomet低速切片机(Bueh ler，美国);激光扫描共聚焦显微镜(LEICA TCS SP5型，德国);罗丹明B(Rhodamine－B，Sigma公司，美国)。

1.2 方法

自天津医科大学口腔医院外科门诊拔除的离体牙中选取牙体完整，无龋损、无裂纹的恒牙30个，刮除牙面软组织及结石后，用高速涡轮机在每个牙的颊面正中制备箱状洞型(颊舌径、近远中径均为4 mm，洞深为2 mm)，要求底平，壁直，点线角圆钝。窝洞制备完成后的所有标本冲洗干燥后随机分为A、B、C 3组:A组弱光引导固化;B组间歇光照固化;C高强度光照固化。分别用Z350复合树脂分层充填，固化，常规抛光。然后用光固化树脂封闭根尖孔，并在距离充填体边缘1mm之外的所有牙面均匀涂布两层指甲油，待其完全干燥后，置于1 g/L罗丹明B荧光染液中37℃水溶条件下浸泡。24 h后取出所有标本蒸馏水冲洗10 s，分别用带有金刚砂片的Isom et低速切片机通过充填体中央将牙齿自颊舌方向沿长轴剖开。检测面用粗、细砂纸依次打磨平整后，分别在100% 相对湿度下用激光共聚焦检测，氩激光扫描(点面扫描2×4，激发波长546 nm，发射波长600 nm)。同时使用LEICA TCS SP5分析软件对图像进行测量并按以下微渗漏分级标准［9］记分:0=无染料渗入;1=染料沿着洞壁渗入，深度＜1/3壁;2=染料沿着洞壁渗入，深度＜2/3壁;3=染料沿着洞壁渗入，深度2/3壁至平齐洞底，但未累及髓壁;4=染料渗入累及髓壁。

1.3 统计方法

采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，计数资料采用秩和检验，计量资料()用单因素方差分析，两两比较用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

肉眼观3组标本均可见罗丹明染料浸入(图1)。激光共聚焦显微镜(CLSM)下可见牙体充填标本的微渗漏呈现清晰的荧光染色图像，3组标本均有染料渗入(图2)。

无论在微渗漏分级还是深度方面，A、B、C 3组间相比均无统计学差异(P＞0.05)(表1～2)。

图1 肉眼观3组染料浸入深度

图2 激光共聚焦显微镜下染料浸入深度(Ⅰ为牙体组织，Ⅱ为复合树脂)

表1 3组标本微渗漏级别比较 (个)

表2 3组标本微渗漏深度比较(μm，)

表2 3组标本微渗漏深度比较(μm，)

3组相比 P＞0.05

组别 微渗漏深度A 1 948.20 ±48.62 B 1 941.90 ±65.80 1 951.60 ±65.48 C

3 讨论

光固化复合树脂材料具有美观性、高粘结性、良好的生物安全性以及与牙体组织有相似的强度等优点，是时下最常用的牙体修复材料。但树脂修复后因树脂材料与牙体组织之间的微渗漏一直没有得到完美解决［1－2］。微渗漏会使窝洞壁与复合树脂之间产生细菌、液体的通道，从而引起术后敏感、充填体着色、继发龋，进一步发展会引起充填体破坏脱落，导致牙髓组织感染，引起牙髓炎、根尖周炎等［3－5］。因此，树脂修复时如何减少甚至消除微渗漏一直是口腔临床医生和材料学家关注的热点。

影响树脂修复体微渗漏的因素有很多种，包括树脂的材料性能、医师技术水平、充填方式、窝洞壁表面玷污层的存在、洞型与洞斜面的制备、粘结剂的选择、牙面酸蚀的程度、光固化灯的种类、光固化的方式、光固化时间及长期咀嚼压力致充填体形变等［6－8］。本实验重点关注光照方式对光固化复合树脂聚合收缩后产生微渗漏的影响。关于不同光照方式对微渗漏的影响一直以来存在两种不同的看法，一方提出弱光引导和间歇光照可提高光固化复合树脂的边缘密闭性，而另有学者则认为弱光引导和间歇光照对光固化复合树脂固化后的边缘密闭性无明显影响。有鉴于此，本实验通过激光共聚焦显微镜观察比较3种光固化方式对树脂修复体边缘微渗漏的影响，以期为临床提供参考。

微渗漏的检测方法有很多种［10－13］，其中染料渗漏研究是牙体微渗漏检测中的重要方法之一［14－15］，根据染料扩散的方式分为顺向法和逆向法。本实验中采用顺向法，即将离体受试牙浸入特定浓度的染液中，一定时间后取出，激光扫描共聚焦显微镜并测量染料沿窝洞壁渗透的深度［16］，以评价充填材料与牙体组织的密合性。

激光扫描共聚焦显微镜，是上世纪中期发展起来并得到广泛应用的高新技术，它突破了光学显微镜不能对细胞或组织内部进行定位检测的限制，弥补了电镜在宏观和动态实时研究等方面的不足，且又克服了其在操作和制样等方面的缺点。激光扫描共聚焦显微镜分析法是利用激光共聚焦显微成像原理发展而成的新技术，具有灵敏度高及可观察空间结构的特点，可应用于细胞标记及非破坏性、非侵袭性的组织器官活体检测等。

激光扫描共聚焦显微镜相对光学显微镜的优点主要体现以下几个方面［14－16］:① CLSM 的图像是以电信号的形式记录下来的，所以可采用各种模拟的和数字的电子技术进行图像处理;②CLSM利用共聚焦系统有效地排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了最佳三维空间定位;③由于CLSM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径;④除具有成像功能外，CLSM还具有图像处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图像重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及Ca2+、pH及其他活细胞内离子的实时定量测定;后者包括粘附细胞的分选、激光细胞显微外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复(FRAP)技术，细胞间通讯的研究，细胞膜流动性测定以及光活化技术。

本结果显示，3种光固化模式对复合树脂固化后的微渗漏无明显影响，与有些实验报道认为弱光引导和间歇光照可改善树脂的边缘密闭性的结果不同，其原因可能是采用了不同的光固化复合树脂材料，因为微渗漏主要是树脂光固化时由聚合收缩应力、粘结力、树脂流动能力在聚合过程中相互作用而致，材料本身的性能是引起聚合收缩、影响边缘密闭性进而引起微渗漏的至关重要的因素，如果采用聚合收缩大、性能较差的复合树脂材料，固化时不同光照方式可能会产生较大的影响。

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