不同的抗原修复方法在免疫组化染色中的应用

郭丽，祁荣，吴鹏

(沈阳医学院科学实验中心，辽宁 沈阳 110034)

目前，免疫组化染色技术已成为病理学诊断的重要手段。几年来抗原修复广泛应用于免疫组化检测，抗原修复使抗原决定簇充分暴露是免疫组化染色成功的关键。在热修复法中，压力锅加热法又较微波炉加热法更有效，酶消化法修复的抗原免疫组化的染色效果不如热修复法[1]。有少数抗原酶消化后染色的结果优于热修复法[2]。电炉煮沸抗原修复法也被许多人所采用。为了选择适宜的抗原修复法，我们先后采用压力锅抗原修复、电炉煮沸抗原修复、复合酶抗原修复法，对五种抗体的免疫组化染色结果进行筛选，选择最适宜的抗原修复法，以获得最佳的免疫组化的阳性结果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与染毒 Wistar大鼠120只(沈阳药科大学实验动物中心提供)体质量230～250 g，按雌∶雄为2∶1于每晚6时合笼，次晨7～9时阴道涂片检查精子，查到精子定为妊娠0 d。实验组从妊娠6 d开始染毒，将NaAsO2溶于蒸馏水中，孕鼠自由饮用，饮水中的砷染毒剂量分别为10、50、100 mg/L，仔鼠出生后，母鼠继续饮含砷水，在仔鼠生后的0、28、42 d分批断头处死仔鼠，取大脑，用10%甲醛溶液固定[3]。

1.2 方法 染毒(蒸馏水配制的NaAsO2自由饮水染毒)剂量为10、50、100 mg/L，为实验组。阴性(自由饮用蒸馏水)对照组。胎鼠出生后，第0天、第28天、第40天分别处死，取大脑，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，组织切片5 μm，暴露大脑皮质及海马。选用鼠抗人单克隆抗体，NMDAR2A、NMDAR2B、NMDAR1、CHAT、ACTH及即用型SABC免疫组化试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。依抗原修复法分3组，5个抗体，每个抗体16例，每例两张切片，即32张/抗体。酶修复法只作了两个抗体。 玻片清洁处理，流水冲洗，酒精浸片，100 ℃烤片，冷却，涂上多聚赖氨酸(1∶10)晾干备用。切片脱蜡水化至PBS备用。切片滴加3% H2O2，室温，10 min，以灭活过氧化物酶。抗原修复：(1)高压加热法：在高压锅内放置装有约500 ml，10 mM/L的枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的法兰缸(或烧杯)，预热至压力锅内水沸腾，将装有切片的金属染色提篮放入缓冲液中(切片组织浸入缓冲液中)，切片之间留出一定的距离，最后一张切片组织应背向金属架[4]，然后高压锅压阀，加压至0.1兆帕，计时2 min，闭电源，自然降压开锅取出法兰缸，冷却至室温。(2)电炉煮沸法：将装有切片的金属染色提篮放入10 mM/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)的法兰缸，然后，放入含有水的用电炉加热的锅内，至锅内的水沸腾开始计时20 min。取出法兰缸自然冷却至室温。(3)酶消化法：滴加消化酶于切片上，37 ℃ 20 min 。免疫组化染色： (1)PBS洗，2 min×3次；抗原修复；5%小牛血清白蛋白20 min；滴加一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗，2 min×3次；滴加二抗，37 ℃ 20 min，PBS洗，2 min×3次；滴加SABC，37 ℃ 20 min，PBS洗，2 min×3次；DAB显色；苏木素精衬染；中性树胶封片。用PBS替代一抗作阴性对照。结果判断：细胞染色出现棕黄色者为阳性。

2 结果

3种抗原修复法的抗原片，免疫组化染色的结果见表1。免疫组化染色组织切片结果显示，用高压锅加热抗原修复法，5种抗体均为核阳性表达，阳性颗粒清楚，染色背景清晰。电炉煮沸抗原修复法只有1种抗体呈阳性。酶消化抗原修复法，随机作了2个抗体，均阳性且颗粒清楚，染色背景清晰，与高压锅加热抗原修复法的阳性结果无区别。

表1 3种抗原修复法对5个抗体的免疫组 化染色结果的比较

3 讨论

目前，免疫组织化学应用中常用的固定剂仍为醛类固定剂，多数学者认为组织经10%福尔马林固定后，抗原会被溶解、弥散、丢失或产生蛋白质交联产物使抗原被掩盖，导致抗原性降低、免疫组化结果抗原不表达、阳性率较低。特别是固定时间长、保留久远的组织蜡块。免疫组化是通过抗体特异地与组织中抗原结合而表达出来，所以抗原修复的方法直接影响到组织中抗原的暴露，因此不能用统一的修复方法，而高压加热法能把被掩盖或交联变性的抗原暴露或修复，使免疫组化的结果更准确可靠。特别是核阳性的组织，适用于高压加热法。电炉煮沸法是抗原修复液和切片放入法兰缸，然后再放入含有水的用电炉加热的锅内，至锅内的水沸腾开始计时20 min，时间长，阳性结果不佳。酶消化抗原修复法由于某试剂不足等原因，随机作了2个抗体，均阳性且颗粒清楚，染色背景清晰，与高压锅加热抗原修复法的阳性结果无区别，本方法可供参考。本研究提示，核阳性表达的抗体应选用高压锅抗原修复法，推测核阳性表达的抗体也适用于酶消化抗原修复法，有待在实验中再进一步探索。建议不同的阳性定位选用不同的修复方法，更具有针对性、稳定性，以便获得最佳的免疫组化的阳性结果。

参考文献：

[1]催永兴，涂静宜，李冬梅，等．不同修复方法对免疫组化染色结果的影响[J]．细胞与分子免疫学杂志，2006，22(3)：390-391．

[2]许燕云，姜国汉，吴艳霞．不同抗原修复方法对cyclin B1在肿瘤中表达的比较[J]．诊断病理学杂志，2004，11(3)：201．

[3]席淑华，郭丽，孙文娟．饮用砷暴露对子代大鼠GAD和GABA-T mRNA表达的影响[J]．中国地方病学杂志，2007，26(1)：9-11．

[4]王晋芬，田相义，丛娟，等．几种抗原修复方法研究[J]．诊断病理学杂志，1997，4(1)：34-35．