TRAF1蛋白在乳腺癌中的表达及意义

代文博，米小轶，林红，刘楠

(1． 沈阳市第一人民医院病理科，辽宁 沈阳 110041；2． 中国医科大学病理学教研室)

肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是细胞内重要的信号传导蛋白，它可与多种肿瘤坏死因子受体和IL-1R/TLR家族成员结合，参与调节NF-κB和JNK等多种信号转导通路的激活，具有调节正常细胞和肿瘤细胞的增殖、存活、凋亡、参与炎症反应等多种功能[1]。TRAF1是TRAF家族成员中的一个分子，有研究表明TRAF1在鼻咽癌和淋巴瘤组织中表达升高[2-3]，但其在乳腺癌中的表达及意义尚不清楚。本实验主要应用免疫组化和Western blot方法研究TRAF1在乳腺癌组织和细胞中表达的变化情况，并分析其与微血管密度之间的关系。

1 材料和方法

1.1 标本来源 70例乳腺癌组织包括35例非浸润性导管癌(导管原位癌)和35例浸润性导管癌来自中国医科大学附属第一医院手术切除存档蜡块。患者均为女性，中位年龄51岁(28～70岁)。对照标本为癌旁非癌乳腺组织，经病理确认为正常乳腺组织共14例。

人雌激素依赖性受体乳腺癌细胞系MCF-7(低侵袭)和人雌激素非依赖性受体乳腺癌细胞系MDA-MB-231(高侵袭)购于中科院上海细胞库。

1.2 主要试剂 TRAF1鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。CD34鼠抗人单克隆抗体购自美国DACO公司。S-P超敏试剂盒和DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。辣根酶标记第二抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DMEM低糖和RPMI 1640培养液、胎牛血清、胰酶购于GIBCO公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法。石蜡切片常规脱蜡至水，以胰酶进行抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断液(37 ℃封闭10 min)，10%非免疫性动物血清(37 ℃孵育40 min)，第一抗体(1∶50，4 ℃冰箱过夜)，生物素标记的第二抗体(37 ℃孵育20 min)，S-A/HRP溶液(37 ℃孵育20 min)，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树脂封片。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.2 细胞培养 MCF-7和MDA-MB-231细胞以常规细胞培养方法分别采用DMEM低糖和RPMI 1640培养液(每100 ml培养液中含10%的FBS，10 mmol/L Hepes，100 U/ml青、链霉素)在37 ℃、5% CO2条件下进行培养。

1.3.3 Western blot方法 取对数生长期细胞，于4 ℃下加入裂解缓冲液(50 mmol/L、Ph 7.4 Tris HCl，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS，1% Triton-100，1 mmol/L EDTA，1.2 μl/ml Aprotinin，6 μl/ml PMSF)，静置30 min，低温高速离心(4 ℃，12 000 r/min，30 min)，保留上清。采用Folin酚试剂法进行蛋白定量。取等量蛋白，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，5%浓缩胶中恒压(电压80 V，电流0.01 A)电泳约15 min，12%分离胶中恒压(电压120 V，电流0.02 A)电泳约50 min后，取下凝胶进行转印(恒压，电压40 V，2 h)，取出PVDF膜经TBS液洗涤10 min后，封闭液封闭2 h，第一抗体(鼠单克隆抗体均为1∶150稀释，兔多克隆抗体为1∶200稀释)4 ℃过夜，辣根酶标记第二抗体(1∶1 500稀释)室温孵育2 h，DAB显色。实验结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定，对比两种细胞系中表达的差异。实验重复3次。

1.4 免疫组化结果判定 TRAF1判定标准参见许良中等[4]的免疫组织化学反应结果的判断标准。

CD34判定标准为：由内皮细胞形成的条索、腔隙状等孤立或簇状结构的棕黄色染色及有管腔者(管腔小于8个红细胞大小的)按一条微血管计数。先在低倍镜(×10)下找到肿瘤组织血管最密集区域，再在高倍镜(×20)下计数3个不重复视野内的微血管数，取其平均值作为最终微血管密度。

1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计分析软件，TRAF1在乳腺癌组织中的表达采用χ2检验，在乳腺癌细胞系中的表达、与微血管密度之间的关系采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRAF1在乳腺癌组织中的表达 TRAF1在正常乳腺组织中不表达，表达于乳腺癌的肿瘤细胞胞浆内(图1)。

图1 TRAF1在正常乳腺(A)、非浸润性导管癌(B)、浸润性导管癌(C)组织中的表达(SP×400)

TRAF1阳性表达率在乳腺非浸润性导管癌中高于正常乳腺组织，但差异无统计学意义(P>0.05)。在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率明显高于正常乳腺组织(P<0.05)。在乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率明显高于非浸润性导管癌 (P<0.05)，见表1。TRAF1表达与乳腺癌侵袭性相关。

表1 TRAF1在乳腺癌组织中的表达

注：1)与正常乳腺组织、非浸润性导管癌比较P<0.05

2.2 TRAF1在乳腺癌细胞中的表达 TRAF1在乳腺癌高侵袭细胞系MDAMB-231的表达量高于低侵袭细胞系MCF-7，但差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

图2 TRAF1在高、低侵袭乳腺癌细胞系中的表达注：1．低侵袭细胞系MCF-7；2．高侵袭细胞系MDA-MB-231

2.3 TRAF1与微血管密度之间的关系 乳腺浸润性导管癌中，TRAF1阳性表达的微血管密度平均值(MVD)(80.96±13.77)明显高于阴性表达组(66.08±24.24)(P<0.05)，TRAF1表达与浸润性导管癌的微血管密度有关。

3 讨论

TRAF家族成员是细胞内重要的信号传导蛋白，它一方面借助自身羧基端的TRAF同源结构域，与不同的细胞表面受体蛋白相结合，另一方面它通过氨基端含有的环指/锌指结构域，介导DNA-蛋白质或蛋白质-蛋白质间的相互作用，将信号向下游传递[5]。

TRAF1是TRAF家族成员中的一种，在正常组织中表达较局限，只表达于脾、肺、睾丸。研究证实TRAF1是一种抗凋亡蛋白，TRAF1过表达抑制CD8+T淋巴细胞凋亡[6]。Siegler等[3]研究表明TRAF1在霍奇金淋巴瘤中过表达。另有研究表明TRAF1在鼻咽癌中表达高于癌旁组织，提示其过表达可能发挥抑制癌细胞凋亡的作用[2]。Suqhra等[7]认为TRAF1通过调节NF-κB通路来发挥其抗凋亡功能。近来的研究表明，TRAF1-C5单核苷酸多态性还与类风湿关节炎的发生密切相关[8]。

肿瘤的血管生成为肿瘤的浸润转移提供了途

径。TRAF信号通路中的一些分子如TNF、TWEAK 、NF-κB等均被证实具有促进血管生成的功能[9-10]，而TRAF作为重要的信号传导分子是否具有促血管生成功能尚不知晓。

我们的研究结果表明，TRAF1在正常乳腺组织中不表达，在浸润性导管癌中的表达明显高于正常乳腺组织和非浸润性导管癌，此外TRAF1在高侵袭细胞系中的表达也高于低侵袭细胞系，提示TRAF1表达量的改变可能与乳腺癌侵袭性相关。TRAF1在乳腺癌组织中的表达是否抑制乳腺癌细胞凋亡仍需进一步研究。此外，乳腺浸润性导管癌中TRAF1与微血管密度呈正相关，提示TRAF1可能在乳腺癌的血管生成过程中发挥一定的作用。

参考文献：

[1]Aggarwal BB．Tumour necrosis factors receptor associated signaling molecules and their role in activation of apoptosis， JNK and NF-κB [J]． Ann Rheum Dis， 2000， 59(suppl I)：i6-i16．

[2]王承兴，邓锡云，李晓艳，等．TRAF1在鼻咽癌及癌旁组织中的表达[J]．癌症，2000，19(9)：857-859．

[3]Siegler G， Kremmer E， Gonnella R， et al． Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 (LMP1) and TNF receptor associated factors (TRAF)： colocalisation of LMP1 and TRAF1 in primary EBV infection and in EBV associated Hodgkin lymphoma[J]． Mol Pathol,2003， 56(3)：156-161．

[4]许良中，杨文涛．免疫组织化学反应结果的判断标准[J]．中国癌症杂志， 1996， 6(4)：229-231．

[5]辛利君． TRAF：一种重要的接头分子 [J]． 国外医学 免疫学分册， 2002，25(3)：143-146．

[6]Speiser DE，Lee SY， Wong B， et al． A regulatory role for TRAF1 in antigen-induced apoptosis of T cells[J]．J Exp Med，1997，185：1777-1784．

[7]Sughra K， Birbach A， de Martin R， et al． Interaction of the TNFR-receptor associated factor TRAF1 with I-kappa B kinase-2 and TRAF2 indicates a regulatory function for NF-kappa B signaling[J]． PLoS One， 2010 ， 5(9)：e12683．

[8]Plenge RM， Seielstad M， Padyukov L， et al． TRAF1-C5 as a risk locus for rheumatoid arthritis--a genome wide study[J]． N Engl J Med， 2007，357(12)：1199-1209．

[9]Donohue PJ， Richards CM， Brown SA， et al． TWEAK is an endothelial cell growth and chemotactic factor that also potentiates FGF-2 and VEGF-A mitogenic activity[J]． Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23(4)：594-600．

[10]Takashi K， Paul S， Ashish K， et al． Nuclear factor-kappaB mediates angiogenesis and metastasis of human bladder cancer through the regulation of interleukin-8[J]．Clin Cancer Res， 2003， 9：2786-2797．