LPLUNC1对上呼吸道抗感染防御机制的影响

周伟强，冯秀艳，李宇恒

(1．沈阳医学院基础医学院病原生物学教研室，辽宁 沈阳 110034；2．沈阳医学院沈洲医院医务科；3．沈阳医学院基础医学院2011级临床医学专业13班)

上呼吸道包括口腔、鼻咽部、气管和支气管，是与外界接触的门户，是病原生物体进入宿主体内的主要通道，有大量的细菌等微生物的积聚。宿主在正常状态下能够保持一种低度无菌的状态，这和宿主防御机制有很大的关系[1，2]。近年来通过cDNA文库筛选以及微芯片表达测定发现一类在上呼吸道上皮高表达，与上呼吸道宿主防御密切相关的蛋白家族—PLUNC( Palate， Lung， Nasal， cDNA )[3-5]。LPLUNC1作为PLUNC家族蛋白中的重要成员，从基因表达的方式、基因组的保守性以及蛋白结构预测分析来看，与杀菌性/通透性增加蛋白(bactericidal/ permeability-increasing protein， BPI)高度相似[6，7]，BPI的主要作用是结合革兰阴性菌细胞壁外围的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)成分，阻止其介导的免疫反应。本文拟将LPLUNC1作为上呼吸道抗感染的候选分子，对其在宿主细胞内可能存在的抗感染防御机制做一初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料 鼠源性RAW 264.7细胞系、pDNR-LIB质粒(american type culture collection， ATCC)；pGEX-4T3质粒、thrombin凝血酶(GE Healthcare)；绿脓杆菌LPS(Sigma-Aldrich)；B-PER GST 融合蛋白纯化系统(Thermo Scientific)；鼠TNF-α Quantikine ELISA 试剂盒(R & D Systems)、鼠CD14 ELISA试剂盒(Cell Sciences)、细胞凋亡检测ELISA试剂盒(Roche)；羊抗CD14单克隆抗体(Santa Cruz)；羊抗TNF-α多克隆抗体、羊抗β-actin抗体(Abcam)；羊抗GST多克隆抗体(GE Healthcare)；包被HRP的兔抗羊单克隆抗体(Bio-Rad Lab)。

1.2 RAW 264.7细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养液(含100 μg/ml青链霉素)在5%CO2、37 ℃饱和湿度下培养。

1.3 GST-LPLUNC1融合蛋白的获取 根据pDNR-LIB质粒中所包含的鼠源性LPLUNC1 cDNA全长序列应用Jellyfish生物软件查询其开放式阅读框架区域(open reading frame， ORF)，经PCR亚克隆至pGEX-4T3 质粒中。GST-LPLUNC1-pGEX-4T3 重组质粒转化至BL21 感受态细胞中大量增殖。GST-LPLUNC1融合蛋白经0.4 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG)诱导、B-PER GST 融合蛋白纯化系统处理后，抽取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色观察提取蛋白的纯度，应用羊抗GST多克隆抗体进行Western blot进一步确定LPLUNC1-GST融合蛋白的存在，最后应用thrombin按1 U/100 mg蛋白浓度消化酶切GST标签得到单一纯化的LPLUNC1蛋白。

1.4 微量肉汤稀释法测定细菌集落形成 将200 μl指数期生长的绿脓杆菌(P. aeruginosa，本室冻存)与MH肉汤(Mueller Hinton Broth，MH)混合后按4×105CFU/ml密度接种于96孔板各孔中。用0.01%的醋酸溶液倍比稀释后的LPLUNC1蛋白溶液分别加到上述96孔板各孔中，第1至第4孔加LPLUNC1蛋白溶液，第5孔加0.1%人血清白蛋白溶液作为对照，每孔22 μl。第1孔至第4孔LPLUNC1蛋白终浓度分别为1.28、 0.32、 0.08、 0.02 mg/ml。按LPLUNC1蛋白液与绿脓杆菌液作用时间的不同，将实验组分为：T(min)=0、30、60、120和240。待各孔中LPLUNC1蛋白与绿脓杆菌作用时间完毕后，各取出200 μl混合液接种于胰酶大豆琼脂培养基中，37 ℃孵育16～20 h后计数细菌集落形成数量评定结果。

1.5 体外LPS结合实验 将绿脓杆菌的LPS和PBS混合成10 ng/ml溶液后，以200 μl/孔接种于96孔板中室温过夜孵育。将含有完整LPLUNC1-GST融合蛋白按0、20、40 μg/ml浓度与上述各孔中混有绿脓杆菌LPS成分室温作用3 h，加入40 μg/ml BSA作为阴性对照。待孵育完毕后加入羊抗GST多克隆抗体及包被HRP的兔抗羊单克隆抗体进行ELISA检测相关样品信号。

1.6 细胞凋亡测定 将1×104RAW 264.7 细胞接种于96孔板中37 ℃孵育24 h，加入200 μl 含有10 ng/ml LPS和1.28 mg/ml 纯化LPLUNC1蛋白的培养液37 ℃孵育48 h。细胞经离心裂解后按细胞凋亡检测ELISA产品说明书操作程序，测定样品中组蛋白-DNA片段复合物的相对含量，评定LPLUNC1诱导靶细胞细胞凋亡的程度。

1.7 CD14， TNF-α ELISA、Western blot分析 将5×105RAW 264.7 细胞接种于100 mm细胞培养皿37 ℃孵育24 h，加入10 ng/ml LPS和1.28 mg/ml 纯化的LPLUNC1蛋白37 ℃孵育48 h。细胞经胰蛋白酶消化、离心后，取细胞上清液按鼠CD14抗原ELISA试剂盒和鼠TNF-α Quantikine ELISA 试剂盒产品说明书操作程序进行ELISA测定。同时将离心后的细胞团块经B-PER裂解液裂解，应用BCA法检测蛋白浓度。取20 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，PVDF转膜、封闭。加入1∶1 000稀释的羊抗CD14单克隆抗体、羊抗TNF-α多克隆抗体4℃孵育过夜，以羊抗β-actin抗体作对照。再加入1∶5 000包被HRP的兔抗羊单克隆抗体室温孵育1 h，ECL化学发光测定细胞中CD14， TNF-α的表达。

2 结果

2.1 LPLUNC1融合蛋白的表达和纯化 55 kDa LPLUNC1蛋白和26 kDa GST 蛋白经GST-Pulldown 蛋白纯化系统扩增生成一约80 kDa LPLUNC1-GST的融合蛋白。20 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色后，从图1-A中观察到经原核细胞GST系统扩增，三次洗脱后得到大量纯化的LPLUNC1-GST融合蛋白；图1-B Western blot结果确定洗脱后获得的蛋白为高纯度的LPLUNC1-GST融合蛋白。

图1 LPLUNC1融合蛋白的表达和纯化注：A：SDS-PAGE电泳结果 B：Western blot 检测LPLUNC1-GST融合蛋白 M： 蛋白分子量标准 E： 蛋白洗脱液 FT： 蛋白抽提液

2.2 LPLUNC1在宿主抗感染防御机制中的作用 将革兰阴性菌绿脓杆菌与LPLUNC1按浓度及时间区段共同培养后分别计数细菌集落形成数量。结果表明，与单独培养的绿脓杆菌对照组相比，无论LPLUNC1蛋白浓度的增加(0.02、0.08、 0.32、1.28 mg/ml)还是LPLUNC1作用时间的延长(0、30、60、120、240 min)对细菌集落的生成都不具有统计意义上的差异，这说明LPLUNC1没有显现出明显的直接抑制细菌生长的特性(图2-A)；但当其与绿脓杆菌的LPS成分共同孵育时，LPLUNC1表现出高度结合LPS的特性(图2-B)。当测定LPLUNC1和LPS作用下靶细胞中组蛋白-DNA片段复合物含量时发现，LPLUNC1-LPS的结合没有导致靶细胞内组蛋白-DNA片段复合物含量的明显变化，由于组蛋白-DNA片段复合物含量反映细胞内发生凋亡的程度，因此LPLUNC1-LPS没有诱导靶细胞发生细胞凋亡(图2-C)。

图2 LPLUNC1在宿主抗感染防御机制中的作用注：A： 微量肉汤稀释法检测LPLUNC1直接杀菌 B：LPLUNC1体外结合LPS实验 C：LPLUNC1诱导细胞凋亡测定 * P<0.05

2.3 LPLUNC1-LPS抑制CD14介导的胞内信号转导 在RAW 264.7细胞中加入LPS和LPLUNC1共同培养24 h后，ELISA测定细胞上清液中CD14和TNF-α含量，并用Western blot测定细胞裂解液中CD14含量。CD14、TNF-α ELISA(图3-A，3-B)及CD14 Western blot(图3-C)结果可见：LPS可诱导靶细胞膜上CD14受体以及细胞内细胞因子TNF-α的表达，LPLUNC1与LPS的结合大大抑制了作用效果，单独应用LPLUNC1时，CD14及TNF-α表达不增强。由此可见，LPLUNC1是通过与LPS的结合，阻止CD14受体的激活，进而影响胞内细胞因子的表达，启动宿主对感染的防御免疫反应。

3 讨论

病原生物体粘附在宿主细胞或组织表面，克服机体局部的防御机制，特别是干扰或逃避宿主局部的吞噬作用及分泌抗体介导的免疫作用，持续存在或增殖引发感染。LPS作为革兰阴性菌细胞壁的主要组分之一，对于激发人的免疫反应极其重要。在人体免疫系统对抗细菌入侵时，LPS作为重要的抗原分子可被抗原递呈细胞(antigen presenting cell， APC)捕获，从而引起机体的免疫反应。

图3 LPLUNC1-LPS胞内信号转导机制注：A： TNF-α ELISA结果 B：CD14 ELISA结果 C：CD14 Western blot结果 β-actin为内参对照 * P<0.05

一般认为，CD14在以革兰阴性菌为主因的呼吸道感染中发挥重要的作用，它对于提升机体对革兰阴性菌的免疫反应十分必要[8]。CD14按存在的部位可分为在单核细胞等细胞膜锚定存在的CD14(mCD14)和在正常人和动物的血清中游离存在的可溶性CD14(sCD14)两种。mCD14是革兰阴性菌感染信号传播的关键，是机体对抗各种病原体、启动早期免疫反应的关键受体[9]。有报道指出，CD14基因敲除小鼠(KO Mice)接种革兰阴性致病菌-类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)后，细胞因子TNF-α表达量大为减少，而血液中细菌数量大为增加。这说明单核细胞等机体免疫细胞中的CD14受体功能对于调节LPS诱导细胞因子表达，激活免疫应答是非常重要的。CD14受体并不是随着LPS刺激增强而无限表达，在感染中晚期，细胞膜上的mCD14大量脱落转变为sCD14，而sCD14可介导血液中单核细胞对细菌的吞噬作用，并使机体的炎性反应强度降低。

尽管目前LPLUNC1等PLUNC家族蛋白的功能还不是很清楚，但它与BPI、脂多糖结合蛋白(LPS-binding protein， LBD)在蛋白三维结构上高度同源，被认为是一种早期免疫分子，是革兰阴性菌感染的传感器。Vitorino等[10]就指出在受到外伤感染时，PLUNC蛋白在人和其它哺乳动物的唾液、鼻咽分泌物中表达水平大幅增强。有大量证据表明，PLUNC1家族蛋白可通过直接杀菌、结合LPS介导胞内细胞因子表达等多种方式参与宿主抗感染防御[11]。从我们的研究结果中可以看出，LPLUNC1没有明显的直接抑制革兰阴性菌生长的特性，也不具备明显的直接杀伤革兰阴性菌的功能。从细胞凋亡测定来看，它也没有诱导单核细胞凋亡的产生，但它可结合革兰阴性菌LPS成分，具有高度敏感性，在LPLUNC1浓度很低时就可表现出高度结合LPS的能力。LPLUNC1与LPS的结合可竞争性抑制LPS与靶细胞膜表面CD14受体的结合，进而阻止信号转导通路及相关胞内TNF-α等细胞因子的表达而促发宿主抗感染防御。

由于CD14受体胞内部分仅有一小段跨膜区，在介导LPS信号转导过程中还需要细胞膜其它受体如TLR2、TLR4以及胞内MD-2(Myeloid differentiation factor-2)分子等进一步传递信号以达到激发胞内细胞因子表达的目的[12，13]，因此继续寻找抗感染防御过程中可能存在的其它重要受体蛋白和激酶通路十分必要。本研究将LPLUNC1作为上呼吸道早期抗感染的候选分子，证实了LPLUNC1具有结合革兰阴性菌LPS成分，抑制胞内细胞因子表达的特性，对于宿主早期抗感染防御启动意义重大，对于预防上呼吸道感染、研发相关呼吸道疾病药物都具有重要的临床现实意义。

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