HPLC法同时测定口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸的含量

张子建，孙冬晓，董立华，王春英*

（1.河北省中医院口腔科，河北石家庄 050017；2.河北医科大学药学院药物分析教研室，河北石家庄 050017）

HPLC法同时测定口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸的含量

张子建1，孙冬晓2，董立华2，王春英2*

（1.河北省中医院口腔科，河北石家庄 050017；2.河北医科大学药学院药物分析教研室，河北石家庄 050017）

目的建立同时测定口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸含量的方法。方法采用高效液相色谱法（high pressure liquid chromatography，HPLC），迪马DiamonsilTMC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.1%甲酸为流动相梯度洗脱，检测波长为300nm，流速1.0mL/min，柱温为30℃。结果肉桂酸质量浓度在2.0～18.0mg/L范围内与峰面积良好的线性关系（r=0.999 9，n=5），平均加样回收率为99.72%，相对标准差（relative standard deviation，RSD）为1.0%；绿原酸质量浓度在4.3～38.7mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.998 2，n= 5），平均加样回收率为102.2%，RSD为0.7%。结论该方法准确，快速，简便，重现性好，回收率高，适用于口炎清颗粒的质量控制。

口炎清颗粒；绿原酸；色谱法，高压液相

口炎清颗粒是由天冬、麦冬、玄参、山银花和甘草等5味中药根据中医理论用现代科技方法精制而成的中药复方制剂（国家中药保护品种）。其疗效确切［1］，作用显著，具有清热养阴、解毒消肿的功效，用于治疗阴虚火旺所致的口腔溃疡［2］。现行质量控制方法为采用高效液相色谱法测定绿原酸含量［2］。本实验旨在采用高效液相色谱法（high pressure liquid chromatography，HPLC）法同时测定口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸含量的方法，以便于提供更为全面的质量控制方法。

1 仪器与材料

Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪，DAD检测器；绿原酸和肉桂酸对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号分别为0737-9709和0844 -200003，供含量测定用）。乙腈为色谱纯（迪马公司），水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。口炎清颗粒为市售（批号10090331，10012302，11052026）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：迪马DiamonsilTMC18色谱柱（4.6mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.1%甲酸为流动相，梯度洗脱（0～5min，20%乙腈；5～15min，20%～30%乙腈；15～25min，30%～70%乙腈；25～26min，70%～100%乙腈）；流速为1.0mL/min；检测波长为300nm；柱温为30℃，进样量10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸和肉桂酸对照品适量，加甲醇制成浓度分别为1.00g/L和1.07g/L的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备：精密称定本品1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10mL称定质量，超声处理1h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心（12 000r/min）20min，取上清液即得。

2.3 专属性实验：按处方量分别制备不含山银花和玄参药材的阴性样品，按“供试品溶液的制备”方法制成山银花阴性对照溶液和玄参阴性对照溶液，依法测定。结果表明，在绿原酸和肉桂酸相应的保留时间范围内无干扰色谱峰出现（图1）。

2.4 标准曲线的制备：精密量取绿原酸和肉桂酸对照品溶液适量，加甲醇制成含绿原酸和肉桂酸浓度分别为2.0mg/L和4.3mg/L、6.0mg/L和12.9mg/L、10.0mg/L和21.5mg/L、14.0mg/L和30.1mg/L、18.0mg/L和38.7mg/L的混合对照品溶液，摇匀。进样，分别记录绿原酸和肉桂酸的峰面积，以峰面积对样品浓度进行线性回归。绿原酸的回归方程为，Y=879.25X+5.135，r=0.998 2。表明绿原酸在2.0～18.0mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系；肉桂酸的回归方程为，Y=1069.5X -1.265，r=0.999 9。表明肉桂酸在4.3～38.7mg/ L范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 回收率实验：精密称定含绿原酸、肉桂酸浓度分别为1.37mg/g和1.70mg/g的样品（批号10090331）0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇10mL，称定质量，超声处理1h，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，离心（12 000r/min）20min，取上清液即得。精密加入浓度为1.00g/L的绿原酸对照品溶液0.6mL和浓度为1.07g/L的肉桂酸对照品溶液0.8mL，加甲醇稀释到刻度，摇匀，离心（12 000r/min）20min，取上清液依法测定，平行测定6次，计算加样回收率。肉桂酸的平均加样回收率为99.3%，相对标准差（relative standard deviation，RSD）为1.6%，绿原酸的平均加样回收率为100.5%，RSD为1.9%。

图1 HPLC色谱图A.绿原酸和肉桂酸混合溶液；B.样品溶液；C.样品溶液加绿原酸和肉桂酸；D.山银花阴性对照溶液；E.玄参阴性对照溶液1-绿原酸（chlorogenic acid）2-肉桂酸（cinnamic acid）Figure 1 The HPLC chromatograms of each samp leA.Standard mixed solution of chlorogenic acid and cinnamic acid；B. Sample solution；C.Sample solution spiked with chlorogenic acid and cinnamic acid；D.Negative control solution of lonicera confusa DC；E. Negative control solution of raidix scrophulariae

2.6 精密度实验：取同一样品溶液，连续进样6次，测得肉桂酸和绿原酸峰面积的RSD分别为1.0%和0.7%。

2.7 重复性实验：取同一批（批号10090331）样品，按“2.2.2项供试品溶液的制备”方法，平行制备6份溶液，依法测定峰面积，肉桂酸和绿原酸浓度的RSD分别为1.2%和0.8%。

2.8 稳定性实验：按“2.2.2项供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，分别放置0、1、2、4、6、8h后，依法测定。计算得绿原酸和肉桂酸浓度的RSD分别为1.6%和0.9%，结果表明，肉桂酸和绿原酸在样品溶液中放置8h稳定。

2.9 样品测定：取口炎清颗粒样品3批（批号10090331、10012302、11052026），分别按“2.2.2项供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，按上述方法进行测定。分别计算样品中肉桂酸和绿原酸的含量。结果见表1。

表1 口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸的含量Table 1 Contents of chlorogenic acid and cinnam ic acid in Kouyanqingkeli

3 讨 论

测定波长选择时发现，绿原酸和肉桂酸的λmax分别在327nm和285nm处，但是样品在327nm和285nm下的色谱图中二者对应的保留时间处均有干扰峰存在。实验表明，在300nm处2种组分均有良好吸收，且相应保留时间处无杂质峰出现，故选择在300nm处同时测定绿原酸和肉桂酸的含量。样品前处理采用甲醇超声提取，离心后测定的方法处理过程简单，方便快速，减少有效物质的损失。结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，能准确测定口炎清颗粒中绿原酸和肉桂酸的含量，可用于评价该制剂的质量。

［1］ 曾宪涛.他克莫司软膏加口炎清颗粒治疗糜烂型OLP的疗效评价［J］.临床口腔医学杂志，2011，27（7）：432-433.

［2］ 中华人民共和国药典委员会.中国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：465-466.

（本文编辑：刘斯静）

DETERM INATION OF CHLOROGENIC ACID AND CINNAM IC ACID IN KOUYANQINGKELIBY HPLC

ZHANG Zijian1，SUN Dongxiao2，DONG Lihua2，WANG Chunying2*
（1.Department of Stomatology，Hebei Provincial TCM Hospital，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Pharmaceutical Analysis，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo establish the method for simultaneous determining chlorogenic acid and cinnamic acid in Kouyanqingkeli.MethodsThe experiments were performed using HPLC with C18 column（250mm×4.6mm，5μm）as an analytical column.The mobile phase was acetonitrile 0.1% formic acid with gradient elution.The detection wavelength was chosen at 300 nm.The flow rate was 1.0mL/min.The column compartmentwas kept at the temperature of 30℃.ResultsThe linear rang of cinnamic acid was 2.0～18.0mg/L（r=0.999 9，n=5），and the mean recovery was 99.72%with relative standard deviation（RSD）of 1.0%.The linear rang of chlorogenic acid was 4.3～38.7mg/L（r=0.998 2，n=5），and themean recovery was102.2%with RSD of0.7%.ConclusionThemethod was proved to be very accurate，rapid，simple and stable for the quality control of Kouyanqingkeli.

Kouyanqingkeli；chlorogenic acid；chromatography，high pressure liquid

R917

A

1007-3205（2012）02-0172-03

2011-11-14；

2012-01-15

河北省科技支撑计划项目（072761954）

张子建（1972-），男，河北高阳人，河北省中医院主治医师，医学硕士，从事口腔疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：wangcy730301@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.020