SET8基因3’端非翻译区的m iR-502结合位点单核苷酸多态性与肝癌患者预后的关系

李进军，张瑞星，杨 华，张风宾，郭占军*

（1.河北医科大学第四医院医疗保险办公室，河北石家庄 050011；

2.河北医科大学第四医院消化内科，河北石家庄 050011））

·论 著·

SET8基因3’端非翻译区的m iR-502结合位点单核苷酸多态性与肝癌患者预后的关系

李进军1，张瑞星2，杨 华2，张风宾2，郭占军2*

（1.河北医科大学第四医院医疗保险办公室，河北石家庄 050011；

2.河北医科大学第四医院消化内科，河北石家庄 050011））

目的研究SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性与肝癌患者预后的关系。方法在河北医科大学第四医院完成肝癌患者80例SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性测序分析，生存曲线分析采用Kaplan-Meier方法，组间对比使用Log-rank检验，使用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。结果研究发现肝癌患者SET8基因3’端非翻译区种子区域miR-502结合部位一个多态位点rs16917496 CC基因型患者生存时间较长，差异有统计学意义（相对危险度0.187，95%可信区间0.073～0.757，P= 0.005）。结论SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性是肝癌患者预后的一种独立危险因素。

肝肿瘤；RNA；预后；多态性，单核苷酸

肝癌是第4大常见恶性肿瘤，每年大约有50万患者死亡，病死率居世界第3位，肝癌的恶性程度和缺乏有效的治疗手段困扰着研究人员，肝癌的发生与多种风险因素有关，包括慢性乙型肝炎病毒，慢性丙型肝炎病毒和酒精损害等［1］。在亚洲和非洲，慢性乙型和丙型肝炎病毒流行高于其他大洲，因此肝癌的发生率在这2个大洲持续升高，在中国慢性乙型肝炎病毒感染是一个具有挑战的健康问题，大约9 000万人是病毒携带者，其中3000万人已经出现慢性肝脏损害。同时在中国酒精性肝病患者也持续增加，人口统计发现6.6%男性和0.1%女性被诊断为酒精依赖，很多人将发展为肝病，而酒精性肝病和肝硬化更容易进展为肝癌［2］。尽管临床诊断和治疗有了长足发展，但肝癌复发机会仍很高，预后差。到目前为止肝癌致病的机制仍不明确，本研究探讨SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性与肝癌患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2003年9月—2008年7月河北医科大学第四医院肝胆外科手术患者80例，其中男性66例，女性14例，年龄23～70岁，平均58.4岁，包括乙型肝炎相关性肝癌患者56例，酒精性肝癌患者10例，丙型肝炎相关性肝癌患者14例。患者术后每3个月随访1次，共随访3年，所有患者术后未接受化疗或放疗，术前均空腹抽取外周静脉血，外周血标本当天提取DNA后置于-80℃恒温冰箱保存。

1.2 研究方法：PCR扩增DNA和序列分析，正向和反向引物，5-TCACGACGGTGCTACCTAAG-3，5-CATGCTGGTGTGACACAGTC-3，依据NCBI数据库扩增SET8基因3’非编码区rs16917496目的片段基因。使用PCR预混试剂盒进行扩增，PCR产物纯化后测序，测序试剂为BigDye terminator v3.1，测序仪器为ABIPRISM31000XL DNA序列分析仪，同一标本采用双向重复测序。

1.3 统计学方法：应用SPSS11.5统计学软件进行分析，生存曲线分析采用Kaplan-Meier方法，组间对比使用Log-rank检验，使用Cox风险回归模型进行多因素分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本研究共收集患者80例，患者的临床特征和3年生存期分析使用Kaplan-Meier方法，采用Logrank检验。研究发现患者的性别和年龄与术后生存时间无关，而肿瘤大小、肿瘤数量、Child分级和有无门脉瘤栓与生存时间有关，结果见表1。不同临床分期患者有相应地生存率，Ⅰ～Ⅱ期患者生存率为46.3%，Ⅲ期患者生存率为0.0%，不同的分期其生存时间有明显差别，经Log-rank检验差异有统计学意义（P＜0.01）；有无门脉瘤栓和Child分级与患者总的生存时间有关（P＜0.01，P＜0.05）；同时发现肿瘤＞5cm和≤5cm比较，单个肿瘤和多个肿瘤比较时，生存时间有明显差异（P＜0.01，P＜0.05）。这些研究发现表明临床分期、有无门脉瘤栓、肿瘤大小、Child分级和肿瘤数量与肝癌患者的预后有关。

表1 肝癌患者的临床特征与术后生存期的关系Table 1 Correlation between clinical characteristics and post-operative survival in HCC patients

本研究对80例肝癌患者多态位点rs16917496的单核苷酸多态性进行测序分析，发现肝癌患者SET8CC、CT和TT基因型频率分别为11、50和72，rs16917496位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。随后我们分析了rs16917496位点多态性和肝癌患者术后生存时间的关系。根据rs16917496位点基因型，肝癌患者被分为3组，术后生存曲线分析采用Kaplan-Meier法。CC、CT、TT 3种基因型患者3年生存率分别为50.0%、39.3%和40.1%，研究发现生存率有明显差异，C/C等位基因型患者相对于C/T和T/T基因型患者生存时间明显延长，差异有统计学意义（CC与CT比较，P= 0.007；CC与TT比较，P=0.011）（图1～2）。CT与TT基因型相比生存时间差异无统计学意义，这些数据表明CC基因型与肝癌患者生存时间长和预后好相关。

图1 SET8基因CC与TT基因型患者生存期比较Figure 1 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith T/T allele

我们使用Cox比例风险回归模型分析了临床分期、门脉瘤栓、Child分级、肿瘤大小和肿瘤数量这些预测因子，研究证实rs16917496位点单核苷酸多态位点可作为肝癌患者预后的独立预测因素（相对危险度0.187，95%CI 0.073～0.757，P=0.005）。临床分期、门脉瘤栓、肿瘤大小、Child分级也可以作为肝癌患者预后的独立的预测因子。这些数据均表明SET8基因rs16917496单核苷酸多态性可作为肝癌患者的预后指标。见表2。

图2 SET8基因CC与CT基因型患者生存期比较Figure 2 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith C/T allele

表2 肝癌患者Cox比例风险回归模型多因素分析Table 2 M ultivariate analysis of prognostic factors associated w ith post-operative survival in HCC patientswith Cox proportional hazardsmodel

3 讨 论

miRNAs是长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子，通过与靶mRNA的互补配对在转录后水平上对基因表达进行调控，导致mRNA降解或翻译抑制。miRNAs在许多生物调节过程中起了重要作用，如细胞生长和凋亡、肿瘤的发生、胰岛素分泌等［3-4］。在人体中发现超过700种miRNAs，这些miRNAs参与了至少30%蛋白质编码基因的调节［5］。越来越多的研究发现miRNAs和端3’非翻译区单核苷酸多态位点结合后导致靶基因表达改变，进而导致肿瘤的发生［6］。在基因研究方面，尽管miRNA结合位点多态性近来被广泛研究，但miRNA结合位点多态性与肿瘤预后关系的研究甚少。

SET8基因编码组蛋白H4赖氨酸20单甲基转移酶，与正常细胞周期有关。SET8mRNA 3’端非编码区有miR-502的结合位点，miR-502与其结合后调节基因的表达，单核苷酸多态位点rs16917496位于SET8基因3’端非编码区miR-502的结合区域内，以往研究发现该位点与SET8基因表达的调节有关，与肿瘤的早期发生有关［7］。

本研究发现SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性可作为肝癌患者预后的指标，该位点单核苷酸多态性与SET8基因的表达的调节有关，基因表达的改变可能通过某种隐性方式影响了肝癌患者的生存时间。本研究首次报道了SET8基因单核苷酸多态性可能是肝癌的一种病因。由于研究的单核苷酸多态位点位于SET8基因3’非编码区与miR-502结合的种子区域，miR-502和SET8基因3’非编码区结合部位rs16917496位点T突变为C改变了原有的G∶C结合，进而影响了SET8基因的表达。我们的研究发现SET8基因表达的改变影响了肝癌患者的预后，而SET8基因表达的调节至少部分与miR-502结合有关。Song等［7］也研究发现SET8基因CC型与RNA表达水平低有关，我们的研究同样发现CC基因型与RNA的低表达有关，肝癌患者CC基因型生存时间长。

多因素分析表明SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性是肝癌预后一种独立因素，与所有miRNAs单核苷酸多态性位点一样，我们所研究的位点单核苷酸多态性也是疾病发生的关键因素［8］。以往研究发现这些单核苷酸多态性与肿瘤的发生有关，是致癌风险因素。

SET8作为一种甲基转移酶，通过与p53基因序列结合的组蛋白382赖氨酸甲基化，进而影响p53基因的表达，改变它的转录活性。SET8的缺失促进了p53的凋亡，影响了它的作用。p53甲基化影响SET8基因的表达与肝癌患者生存率之间的关系需要进一步研究。以往研究发现SET8基因剔除后可以抑制p53的生物活性，进而加速了细胞坏死过程［9］。

Yu等［10］采用病例对照研究发现12个miRNA结合位点单核苷酸多态位点在多种肿瘤中显示出异常的等位基因频率，已经证实SET8基因miR-502结合位点是其中之一。我们研究了该位点单核苷酸多态性在正常对照组中的频率分布，发现差异无统计学意义，但不排除该位点单核苷酸多态性在不同肿瘤中具有不同的作用。

尽管对miRNAs结合位点单核苷酸多态位点的研究处于早期阶段，以往研究发现miRNAs是影响包括肿瘤在内的其他疑难疾病治疗效果的一种关键因素［11］。本研究发现miRNAs等位基因单核苷酸多态位点与肿瘤的发生和预后有关，这是令人鼓舞的。

总之，本研究发现SET8基因3’端非翻译区的miR-502结合位点单核苷酸多态性是肝癌预后的一种独立危险因素，这一发现将有助于划分肝癌患者预后好坏的分组，并有助于肝癌患者治疗方案的选择。

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（本文编辑：刘斯静）

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《河北医科大学学报》编辑部

ASSOCIATION OF POLYMORPHISM AT THE m iR-502 BINDING SITE IN THE 3’UNTRANSLATED REGION OF THE HISTONE METHYLTRANSFERASE
SET8 W ITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA OUTCOM E

LI Jinjun1，ZHANG Ruixing2，YANG Hua2，ZHANG Fengbin2，GUO Zhanjun2*
（1.Medical Insurance Office，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Departmentof Gastroenterology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the association of polymorphism at themiR-502 binding site in the 3’untranslated region（UTR）of the histone methyltransferase SET8 with hepato cellular carcinoma outcome.MethodsThe region of single nucleotide polymorphism（SNP）in the miR-502 binding site of the SET8 3’UTR was sequenced for 80 hepatocellular carcinoma patients recorded in the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Survival curves were calculated using the Kaplan-Meier method，and comparisons between the curves weremade using the Log-rank test.Multivariate survival analysiswas performed using a Cox proportional hazardsmodel.ResultsSingle nucleotide polymorphism（rs16917496）within the miR-502 microRNA seed region for the 3’UTR of SET8 in Chinese HCC patients was found.The SET8 CC genotype was independently associated with longer post-operative survival in HCC patients by multivariate analysis（relative risk，0.187；95%CI，0.073-0.757；P= 0.005）.ConclusionSNP in the miR502 binding site of the SET8 3’UTR was found to be an independent prognostic marker for HCC outcome.

liver neoplasms；RNA；prognosis；polymorphism，single nucleotide

R735.7

A

1007-3205（2012）03-0252-04

2011-11-17；

2012-02-18

李进军（1970-），男，河北宁晋人，河北医科大学第四医院主治医师，医学学士，从事肿瘤防治管理工作。

*通讯作者。E-mail：zjguo5886@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.003