聚合物纳米微球分离纯化染料木素的工艺条件优化

刘晶芝，姜 雨

(1.河北师范大学旅游学院，河北 石家庄 050031；2.国家食品药品监督管理局保健食品审评中心，北京 100061)

大豆异黄酮(Soybean isoflavones)是存在于大豆中的一类重要的生物活性物质，大豆异黄酮苷元主要包括大豆素(Daidzein)、染料木素(Genistein)和黄豆素(Glycitein)等，其中活性最强的为染料木素。染料木素结构与雌二醇类似，能够与雌激素受体结合，发挥雌激素作用，此外，还具有抗肿瘤、抗氧化、抗骨质疏松等作用[1～3]。国内外已批准多种含染料木素的异黄酮产品作为食品用于人群。

目前，染料木素的分离纯化方法主要有三种：一是直接从不含大豆素和黄豆素的植物(如槐角、木豆根茎)中提取，但由于植物中染料木素含量低使得工艺复杂、成本高；二是利用微生物发酵生产染料木素，存在发酵周期长、纯度低等问题；三是从染料木素含量较高的大豆异黄酮苷元混合物中分离，但由于大豆素和黄豆素的结构与其类似，分离比较困难。文献报道从大豆中分离高纯度染料木素的方法有硅胶法、高速逆流色谱法等，存在反复上柱、操作繁琐或处理量小等问题[4，5]。

作者在此采用聚合物纳米微球对大豆异黄酮苷元混合物直接进行层析分离，并对聚合物纳米微球型号、洗脱液体积分数、洗脱速度、载样量等工艺条件进行了优化。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

80％大豆异黄酮苷元混合物(含28％染料木素)，市售；染料木素对照品(编号111704)，中国药品生物制品检定所；聚合物纳米微球，苏州纳微科技公司；乙腈，色谱纯，Merck公司。

中压层析系统，瑞士Büchi公司；中压层析柱(15 mm×230 mm和26 mm×460 mm)；高效液相色谱仪(515泵，996检测器)，Waters公司。

1.2 HPLC色谱条件

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温为室温；流动相为乙腈-0.5％ TFA(35∶65)；流速1.0 mL·min-1；检测波长260 nm；进样量10 μL。

称取染料木素对照品5 mg用甲醇溶解，配制成约500 μg·mL-1的标准储备液；取一定量的标准储备液用甲醇梯度稀释，进行色谱分析，测定染料木素的色谱峰面积，染料木素在浓度为5～500 μg·mL-1时与峰面积有良好线性关系。

1.3 方法

用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡聚合物纳米微球2 h，水洗至中性；然后用0.05 mol·L-1的HCl溶液浸泡2 h，水洗至中性；湿法装柱。将大豆异黄酮苷元混合物用甲醇溶解后注入中压层析柱顶端，用乙醇洗脱，分管收集，计算层析收率。合并纯度大于98％(HPLC面积归一法)的洗脱液，减压浓缩至基本无乙醇，8 ℃放置2 h，过滤，水洗滤饼，真空干燥，得到染料木素粉末。

固定其它条件不变，分别考察聚合物纳米微球型号、洗脱液体积分数、洗脱速度、载样量(样品与填料的质量体积比，g∶mL，下同)对分离纯化效果的影响，以确定最优的分离纯化条件。

2 结果与讨论

2.1 聚合物纳米微球分离纯化染料木素的工艺条件优化

2.1.1 聚合物纳米微球型号的确定

分别用型号为PS25-300、NM-MM100、PSA30-300的聚合物纳米微球40 mL装柱，将0.2 g大豆异黄酮苷元混合物用甲醇溶解后注入层析柱顶端，用60％(体积分数，下同)乙醇洗脱，洗脱速度为2 BV·h-1，每管收集5 mL，HPLC检测，合并纯度大于98％的染料木素洗脱液，计算层析收率，结果见图1。

图1 聚合物纳米微球型号对层析收率的影响

由图1可看出，PS25-300型聚合物纳米微球对染料木素的分离效果最好，层析收率最高。故选择PS25-300型聚合物纳米微球作为染料木素的层析介质。

2.1.2 洗脱液体积分数的确定

将0.2 g大豆异黄酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物纳米微球层析柱顶端，分别用体积分数为50％、60％、70％、80％的乙醇洗脱，洗脱速度2 BV·h-1，HPLC检测，合并纯度大于98％的染料木素洗脱液，计算层析收率，结果见图2。

图2 乙醇体积分数对层析收率的影响

由图2可看出，乙醇体积分数大于60％时，由于洗脱体积小，洗脱速度过快，染料木素和其它大豆苷元一起被洗脱，分离效果不好；当乙醇体积分数小于60％时，由于洗脱体积过大且拖尾现象严重，分离效果也不好；当乙醇体积分数为60％时，染料木素的分离效果最好，洗脱速度适中，层析收率高。故选择洗脱液乙醇的体积分数为60％。

2.1.3 洗脱速度的确定

将0.2 g大豆异黄酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物纳米微球层析柱顶端，以60％的乙醇作为洗脱液，分别采用0.5 BV·h-1、1 BV·h-1、2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1的洗脱速度进行洗脱，HPLC检测，合并纯度大于98％的染料木素洗脱液，计算层析收率，结果见图3。

图3 洗脱速度对层析收率的影响

由图3可看出，洗脱速度过慢，易扩散，染料木素层析收率偏低；洗脱速度过快，洗脱不集中，染料木素与其它大豆苷元得不到有效分离，高纯度染料木素的层析收率也不高；洗脱速度为2 BV·h-1时，高纯度染料木素的层析收率最高。故选择洗脱速度为2 BV·h-1。

2.1.4 载样量的确定

分别按照1∶400、1∶300、1∶200、1∶100、1∶50的载样量上样，用60％乙醇洗脱，洗脱速度2 BV·h-1，HPLC检测，合并纯度大于98％的染料木素洗脱液，计算层析收率，结果见图4。

图4 载样量对层析收率的影响

由图4可看出，在保证分离效果的前提下，随着染料木素载样量的增加，染料木素的层析收率逐渐降低；当载样量超过1∶200时，染料木素与其它苷元得不到有效分离，层析收率显著下降(<50％)；载样量在1∶400～1∶200时，层析收率较稳定。考虑到成本因素，选择载样量为1∶200。

2.2 工艺验证

在确定的最优条件下，即以PS25-300型聚合物纳米微球为分离介质、洗脱液乙醇体积分数为60％、洗脱速度为2 BV·h-1、载样量为1∶200(g∶mL)，在240 mL层析柱(26 mm×460 mm)上进行了3批验证实验，所得染料木素的HPLC图谱见图5。

由图5结果计算可知，PS25-300型聚合物纳米微球对大豆异黄酮苷元中的染料木素有很好的分离纯化效果，平均层析收率大于75％、纯度大于98％。

3 结论

以PS25-300型聚合物纳米微球为分离介质，将大豆异黄酮苷元用甲醇溶解后进行层析分离，用60％乙醇洗脱，洗脱速度控制在2 BV·h-1，载样量为1∶200(g∶mL)，此时，层析收率大于75％、纯度大于98％。该工艺过程简单、易操作、产品收率高、质量可控，可用于高纯度染料木素的分离纯化。

图5 染料木素的HPLC图谱

参考文献：

[1] Guo J M，Xiao B X，Liu D H，et al.Biphasic effect of daidzein on cell growth of human colon cancer cells[J].Food Chem Toxicol,2004,42(10):1641-1646.

[2] Arjmandi B H，Smith B J.Soy isoflavones′ osteoprotective role in postmenopausal women:Mechanism of action[J].J Nutr Biochem，2002,13(3)：130-137.

[3] Dixon R A，Ferreira D.Genistein[J].Phytochemistry，2002,60(3):205-211.

[4] 姚开，贾冬英，何强，等.大豆异黄酮主要单体组分的分离方法[J].四川大学学报，2004，36(3)：77-81.

[5] Du Q Z，Li Z H，Ito Y.Preparative separation of isoflavone components in soybeans using high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2001,923(1-2):271-274.