游泳训练对Ⅱ型糖尿病Wistar大鼠肠系膜动脉舒张功能改善作用的研究

崔贺成

摘要：目的：通过建立wistar大鼠Ⅱ型糖尿病动物模型，观察Ⅱ型糖尿病（T2DM）模型大鼠，经游泳训练后肠系膜动脉舒张功能的变化，并探讨其内在影响机制。方法：实验材料wistar大鼠60只，造模完成后随机分成3组：正常对照组（CON），Diabetes模型组（DI），游泳运动组（SEX），每组15只。进行游泳训练共计8周。结果： T2DM 可造成肠系膜动脉血管舒张功能降低（P＜0。05），且存在内皮依赖性。舒张功能的降低与eNOS—NO系统活性降低直接相关。游泳训练可有效维持内皮依赖性舒张功能（P＜0。05），其上调eNOS—NO系统。另外，T2DM 造成的eNOS—NO系统活性降低与该系统上游蛋白PI—3K，Akt降低有关，且在加入上游蛋白抑制剂（PI—3K）LY294002及eNOS阻断剂L—NAME后保护效应消失。结论：游泳训练能改善T2DM wistar 大鼠肠系膜舒动脉舒张功。其内在保护作用可能是通过部分激活PI—3K—Akt—eNOS信号通路而实现。

关键词：2型糖尿病；游泳训练；肠系膜动脉；舒张功能；PI—3K；Akt；eNOS

中图分类号：G804。7文献标识码：A文章编号：1006—2076（2012）01—0057—05

Abstract：Objective：Through the establishment of wistar rats Ⅱ diabetes animal model， we observed mesenteric artery diastolic function changes of type 2 diabetes （T2DM） in rats intervened with swimming training，to explore the impact of its internal mechanism。Method：After the model was established，60 wistar rats were random divided into three groups：1） normal control group （CON）； 2）diabetes model group （DI）；3） swimming exercise group （SEX）， n = 15。 Swimming training duration was total of 8 weeks。Results：T2DM reduced mesenteric artery diastolic dysfunction （P＜0。05），which was endothelium—dependent。 This change was connected with reduced eNOS—NO system activities。 Swimming training can effectively maintain the endothelium—dependent vasodilatation （P＜0。05） and can increase eNOS—NO system。 In addition， T2DM caused activity decreasing of eNOS—NO system， which was the same to upstream protein PI—3K， Akt。 Furthermore， after adding protein inhibitor （PI—3K） LY294002 and eNOS inhibitor L—NAME， protectiveeffect disappeared。Conclusion：Swimming training can improve mesenteric artery diastolic function of T2DM wistar。 Its protective effect may beinherent in part through the activation of PI—3K—Akt—eNOS signaling pathway。

Key words：Type 2 diabetes； swimming training； mesenteric artery； diastolic function； PI—3K； Akt； eNOS

Ⅱ型糖尿病（T2DM）造成糖、脂代谢紊乱，可导致其它众多并发症[1]。对糖尿病引起的心血管系统并发症日益受到人们的关注[2—3]。相关研究显示，糖尿病引起的糖毒性和脂毒性可通过氧化应激、炎性反应以及糖基化终末产物等从而促进血管舒张功能障碍，进而引发在高血压、动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的发生[4—6]，同时，作为糖尿病并发症的重要病理生理基础——微循环障碍，微循环的功能异常参与整个糖尿病的形成及发展过程。其中很多人由于血管损伤症状而面临截肢、心脏病、中风及失明的威胁。因此，研究糖尿病微循环的改变及探索新的治疗手段对探讨糖尿病的治疗具有重要的意义。

对于糖尿病引发的微循环障碍的治疗，除了使用常规的舒血管物质（ACEI）之外，有氧运动常作为该类疾病的重要的辅助治疗手段。然而，目前有氧运动对心血管保护作用的研究尚处于摸索阶段，阐明其作用机制，对于其更好的应用具有重要意义。本研究通过建立T2DM动物模型，选取游泳训练作为干预手段，检测游泳训练对T2DM造成的肠系膜动脉舒张功能紊乱的改善作用，并对其作用机制进行探索，以期为T2DM的治疗提供新的辅助治疗手段。

1材料和方法

1。1材料

乙酰胆碱（acetylcholine， ACh）、苯肾上腺素（phenylephrine， PE）、磷酸化及总的phosphatidylinositol 3—kinase （PI3K）、Akt、eNOS及其各自抑制剂LY294002和N—硝基—L—精氨酸甲酯（N—nitrl—L—arginine methylester， L—NAME）均购于CST公司（CST，USA）；氯化钙（CaCl2）、硝普钠（SNP）为西安化学试剂厂产品（分析纯）。NO试剂盒（南京建成）。

1。2主要仪器

BL—420F 生物机能实验系统 （成都泰盟）； JH—280425张力换能器（北京航天医学工程研究所）。

1。3研究对象

雄性wistar大鼠60只（购自陕西省中医院动物中心）。6周龄，体重180～200 g，分笼饲养，每笼10只，自由饮食，室温23℃～25℃，湿度40%～60%，阳光充足的条件下饲养。

1。4动物造模

分两阶段进行：①胰岛素抵抗造模；②糖尿病造模。

造模过程[7]：脂肪乳的制备：猪油20 g，甲基硫氧嘧啶1 g，胆固醇5 g，谷氨酸钠1 g，蔗糖5 g，果糖5 g，吐温80 20 ml，丙二醇30 ml，加水定容至100 ml成脂肪乳，灌胃脂肪乳代替普通饮用水，共10 d，造成胰岛素抵抗模型；采用四氧嘧啶腹腔注射， 采取两步给药法（120/100 mg。kg—1），制备糖尿病模型，以16。7 mmol/L的随机血糖作为成模切点，完成后检测造模情况，剔除个别未成功个体。

1。5运动方案

Wistar大鼠随机分成3组：正常对照组（CON），糖尿病组（DI），糖尿病+游泳训练组（DI+SEX），每组15只。对照组和糖尿病安静组不运动，糖尿病+游泳训练组进行60 min/d无负重有氧游泳训练[8]。每周运动5 d，首次运动时间为10 min，随后每天递增10 min，直到增加到60 min，维持此运动时间到实验结束，游泳水温（30±1）℃，水深65 cm，持续运动8周。

1。6饮食方案

在试验期间，各组大鼠采用自然进食（食物充足供给，除饮水和禁食期外）；除正常对照组之外，饮水均由脂肪乳代替。

1。7血管组织内NO含量检测

肠系膜动脉血管用0。9% NaCl （1：10， wt/vol）溶液匀浆，5 000 g离心5分钟，出去沉淀，取上清用NO试剂盒（南京建成生物）进行浓度检测。

1。8肠系膜动脉环等张收缩力检测

处死大鼠后，迅速取出肠系膜动脉，放入K—H液（预先通有4 ℃的 95% O2和 5% CO2混合气体），剥除表面脂肪及结缔组织，剪成长约3 mm 的血管环。对于需要去内皮的血管，则用细的不锈钢丝去除内皮。将样本固定到两个张力测试探针上（一个连接张力换能器，另一个连接张力负荷微调装置）。置于盛有 K—H 液的标本测试槽内，以PE （1×10—5 mol/L）检验动脉环收缩性测试两次，收缩幅度差＜10%为实验开始标准。血管舒张和收缩反应测定具体见张宏丽[9]，收缩反应以血管舒张张力占PE预收缩时的最大收缩张力的百分比表示。

1。9Westen Blot 印迹检测各组PI—3K、AKt及eNOS蛋白表达检测

提取各组肠系膜动脉总蛋白，定量（BCA试剂盒）后，各取50 μg蛋白经12%及15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，之后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。再分别与一抗（PI—3K兔单克隆抗体按1：2 000稀释；AKt兔单克隆抗体按1：5 000稀释；eNOS山羊单克隆抗体按1：2 000稀释）和二抗 （辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或兔抗鼠IgG抗体按1：1 000稀释） 4℃过夜和室温孵育2 h，ECL发光液发光，X光片曝光显像。用BIO—RED图像分析软件quantity one作灰度分析统计。

1。10统计与分析

实验数据以means±SEM 表示。采用 SPSS18。0 统计学软件进行统计分析，组间差异应用单因素方差分析（ANOVA—oneway），Students t—test or ANOVA 用于检测差异的显著性，P＜0。05 为存在显著性。应用GraphPad Prism 5。03 作图。

2结果

2。1游泳训练对wistar大鼠经由Ach 介导的肠系膜动脉舒张功能的影响

图1内皮依赖性和非内皮依赖性各组血管舒张功能变化

注：CON 为正常组；DI为糖尿病模型组；DI+SEX代表游泳训练组。CON E—为正常去内皮组，CON E+为正常内皮完整组。用Bonferronis post hoc检验，进行单因素方差分析各组之间差异的显著性。*P＜0。05 和 ** P＜0。01 vs正常对照（CON）组；#P＜0。05和##P＜0。01 vs 糖尿病模型（DI）组。

图1结果提示，Ⅱ型糖尿病可以造成肠系膜动脉舒张功能减低（P＜0。05），该降低主要存在于内皮，而不是血管平滑肌。初步验证了游泳训练的保护作用主要是通过减轻Ⅱ型糖尿病造成的肠系膜动脉血管内皮的损伤。

然而，游泳训练如何减轻血管内皮损伤，维持血管内皮功能？其内在的作用机制又是什么？接下来我们对其内在作用机制进行研究。eNOS—NO系统在血管舒张功能中起至关的作用[10]。在众多血管中，当eNOS缺失或eNOS活性降低均可以引起舒张功能降低。在正常情况下，血管的舒张反应主要由内皮依赖性的超极化因子介导。但是，当内皮损伤后，NO引起的舒张作用占主导地位。所以，首先检测了eNOS蛋白表达及NO含量。

2。2游泳训练对肠系膜动脉血管eNOS蛋白表达及NO含量的影响

图2游泳训练对肠系膜动脉血管eNOS

蛋白表达及NO含量的影响

注：图2A， eNOS及其磷酸化表达，图2B，各组大鼠肠系膜动脉NO含量检测。CON 为正常组，DI为糖尿病模型组；DI+SEX代表游泳训练组。用Bonferronis post hoc检验，进行单因素方差分析各组之间差异的显著性。*P＜0。05 和 **P＜0。01 vs正常对照（CON）组；#P＜0。05 和 ##P＜0。01 vs 糖尿病模型（DI）组。

图2结果显示，T2DM打破肠系膜动脉eNOS—NO系统平衡。显著性降低eNOS磷酸化水平及NO含量（P＜0。05）。而游泳训练则可以有效提高eNOS磷酸化水平。然而，游泳训练如何上调eNOS磷酸化水平发挥保护作用，其内在机制尚不清楚。众所周知，生存通路（PI3K—Akt）参与众多生理学过程[11]，其作为eNOS—NO系统上游信号级联之一，后者的平衡系统被打破是否是由生存通路抑制而引起？游泳训练是否通过影响其上有通路而上调eNOS—NO系统平衡？接下来检测PI3K—Akt下蛋白表达变化。

2。3游泳训练对生存通路PI3K、Akt活性的影响

图3A结果显示，总PI3K蛋白表达各组之间无差异（P＞0。05），T2DM组PI3K大鼠PI3K磷酸化显著性降低（P＜0。05），而游泳训练组则显著性升高 （P＜0。05）。图3B结果表明， T2DM可直接导致磷酸化Akt水平显著性下降（P＜0。05），而该指标在游泳训练组显著性提高（P＜0。05）。表明游泳训练可以激活该生存通路，初步证实游泳训练对肠系膜动脉舒张作用的增强存在相关性，然缺乏直接的功能学证据，接下来进一步从功能学指标进行验证。

图3游泳训练对生存通路P13K、Akt活性的影响

注：图2A， P—PI3K及其磷酸化表达；图2B AKt及其磷酸化表达统计。CON 为正常组，DI为糖尿病模型组组，DI+SEX代表

游泳训练组。用Bonferroni's post hoc检验，进行单因素方差分析各组之间差异的显著性。* P＜0。05 和 **P＜0。01 vs正常对照（CON）组；#P＜0。05 和 ##P＜0。01 vs 糖尿病模型（DI）组。

2。4加入LY294002及L—NAME后各组大鼠肠系膜动脉舒张功能变化

2。4。1内皮完整情况下，加入阻断剂后肠系膜动脉血管舒张功能变化（图4）

2。4。2去内皮后肠系膜动脉对SNP（内皮依赖性）舒张和CaCl2（非内皮依赖性）收缩功能的影响（图5）

图4、图5结果显示，在加入PI3K（LY294002）及eNOS （L—Name）阻断剂后，内皮依赖性血管舒张功能均受到抑制，而进一步的研究证明去除内皮之后，NO供体对血管舒张功能和收缩功能均无显著性变化，说明PI3K—Akt—eNOS蛋白通路参与了肠系膜血管内皮损伤的过程。同时该结果也为为游泳运动保护肠系膜动脉的舒张功能提供了直接证据，说明游泳训练是通过减轻血管内皮损伤，上调PI3K—Akt—eNOS生存通路而发挥其功能学作用的。

图4内皮完整下加入阻断剂后肠系膜动脉血管舒张功能变化

注：图4A，正常组加入两种阻断剂后舒张功能变化；图4B，糖尿病组加入两种阻断剂后舒张功能变化；图4C，游泳训练组加入两种阻断剂后舒张功能变化。CON 为正常组，DI为糖尿病模型组，DI+SEX代表游泳训练组。用Bonferronis post hoc检验，进行单因素方差分析各组之间差异的显著性。* P＜0。05 和 **P＜0。01 vs正常对照（CON）组；#P＜0。05 和 ##P＜0。01 vs 糖尿病模型（DI）组。

图5去内皮肠系膜动脉对SNP舒张

和CaCl2收缩功能的影响

注：图5A，二型糖尿病和游泳训练对内皮依赖性肠系膜动脉舒张作用的影响； 图5B，二型糖尿病和游泳训练对CaCl2引起的肠系膜动收缩作用的影响。CON 为正常组，DI为糖尿病模型组，DI+SEX代表游泳训练组。用Bonferronis post hoc检验，进行单因素方差分析各组之间差异的显著性。*P＜0。05 和 **P＜0。01 vs正常对照（CON）组；# P＜0。05 和 ##P＜0。01 vs 糖尿病模型（DI）组。

3讨论

本实验主要发现，Ⅱ型糖尿病可导致肠系膜动脉舒张功能降低，其原因是由于内皮功能紊乱，且内皮功能紊乱与PI3K—Akt—eNOS通路活性降低相关；游泳训练可以改善糖尿病内皮依赖性舒张功能降低，其保护效应与其活化PI3K—Akt—eNOS通路活性相关。

3。1Ⅱ型糖尿病造成血管内皮损伤的机制及游泳训练的对内皮的保护作用

糖尿病状态下，高糖诱导线粒体内电子传递呼吸链产生超氧化物过多（ERR—α系统平衡被打破）而造成血糖水平异常升高。在正常生理情况下，单糖通过烯醇化反应，其烯醇化物通过进一步氧化，生成a—酮醛和自由基的相关中间物，病理状态下自由基生成增多，通过改变基因表达而诱导细胞凋亡。同时，高糖促使血管内皮细胞由抗血栓状态转入促血栓形成主导激活或损伤状态。还可促使内皮细胞合成内皮素，由于后者的缩血管及致有丝分裂作用，可进一步造成血管病变形成[12]。另外，高糖可直接激活转化生长因子8潜在形式，通过诱导血纤维蛋白溶酶或其他蛋白来间接地增加活性转化生长因子8的水平。后者水平的升高，不仅可促进血管细胞表达胰岛素样生长因子结合蛋白质引起微血管病变，而且还可抑制内皮细胞表达干细胞生长因子而加重内皮损伤[13—14]。运动训练可以直接降低血糖水平已取得广泛共识，其机制可能是通过提高线粒体功能，上调ERR—α活性加速糖代谢，从而降低呼吸链产生的ROS；运动训练可以提高抗氧化酶的活性（一相和二相酶）[15]，加速对ROS的清除速度，降低血液氧化应激水平也是重要的机制之一。除上述核心作用机制外，运动抑制内皮细胞对内皮素的合成，减少血纤维蛋白溶酶水平也是重要的外周机制。

血脂水平的异常变化也是造成血管内皮损伤的另一重要因素。内皮细胞由于其屏障功能，会对进入内膜的LDL进行氧化修饰后成为ox—LDL，后者具有细胞毒性，可直接引起内皮细胞功能障碍。巨噬细胞吞噬LDL量超过其清除ox—LDL能力时，就会引起巨噬细胞坏死，从而释放出许多溶酶体酶，进一步造成内膜细胞损伤及坏死。游泳训练则可以显著性降低FFA及血液氧化应激水平，提高抗氧化酶活性[15]，提示，游泳训练对血管内皮的保护作用与其降血脂及抗氧化直接相关。

3。2游泳训练改善血管舒张功能的分子机制

本实验和先前研究均证实[16]，糖尿病下调eNOS—NO系统活性。其机制可能与血液中炎症因子增多，氧化应激水平的升高有关。另外，本实验还证实，糖尿病可以显著性降低P13K、PKB表达，其原因主要是由于FFA上调脂肪磷酸酶PTEN表达，而后者是PI3K依赖的信号转导通路重要负性调节因子[17]。糖尿病引起的糖毒性和脂毒性均可造成血管紧缩素、内皮缩血管肽水平升高，这些物质可以减弱eNOS活性，增强血管收缩。

运动可以改善病理状态下血管舒张功能。相关研究显示，运动训练可以提高血管舒张功能，通过上调eNOS磷酸化水平[18]。本研究也证实，游泳训练显著改变乙酰胆碱介导的血管舒张反应，该反应性的改变与上调eNOS—NO系统及其上游蛋白PI3K—Akt生存通路密切相关。提示，游泳训练对肠系膜动脉舒张功能的改善作用是通过，至少部分是通过上调PI3K—Akt—eNOS信号通路而实现。该激活作用可能与游泳训练降低FFA水平而实现，因为FFA水平的异常升高能改变VEGF刺激的PI3K/Akt信号转导失活。除上述机制外，运动上调HSP90表达也可能是另一直接因素，因为后者可直接结合eNOS上调其平衡[19]；另外，运动血液流速加快，造成血管壁切应力的增加也可能一潜在因素，因为正常状态下NO的生成主要靠切应力的刺激所产生[20]。

本研究证实，游泳训练可以改善糖尿病引起的肠系膜动脉血管舒张功能异常。提示，体育锻炼可以作为Ⅱ型糖尿病引起的心血管并发症新的治疗或辅助恢复手段。

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