天女木兰组织培养的抗褐化研究

2012-04-29王欢杜凤国张志翔齐翠翠

湖北农业科学 2012年14期

王欢杜凤国张志翔齐翠翠

摘要：从外植体类型、外植体预处理方法、培养基类型、抗褐化剂类型及培养条件等方面研究了天女木兰（ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈ）组织培养过程中的褐化问题。结果表明，Ｂ５培养基对防止外植体褐化效果好，外植体在ＭＳ培养基中褐化严重。外植体的取材部位与天女木兰的褐化程度密切相关，侧芽褐化率相对较低，其次是顶芽，带芽的茎段褐化率最高。在Ｂ５＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｍｇ／ＬＩＢＡ培养基中添加适宜浓度的抗氧化剂、吸附剂有利于抑制天女木兰的褐化，抗褐化效果是聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）＞维生素C（VＣ）＞活性炭（ＡＣ）。用１ｇ／ＬＶＣ浸泡外植体４ｈ可有效减轻褐化。培养初期一定的低温和暗培养可以减轻天女木兰的褐化。

关键词：天女木兰（ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈ）；组织培养；抗褐化

中图分类号：Ｓ７９２．９９；Ｑ９４３．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3107-03

Study on Browning Controlling of Magnolia sieboldii in Tissue Culture

ＷＡＮＧＨｕａｎ１，２，ＤＵＦｅｎｇ－ｇｕｏ２，ＺＨＡＮＧＺｈｉ－ｘｉａｎｇ１，ＱＩＣｕｉ－ｃｕｉ２

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｃｈｉｎａ；２．ＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂ．ｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＦｏｒｅｓｔｒｙＣｏｌｌｅｇｅ，ＢｅｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｌｉｎ１３２０１３，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｂｒｏｗｎｉｎｇｐｒｏｂｌｅｍ of ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｙｐｅｏｆｅｘｐｌａｎｔｓ，ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｘｐｌａｎｔｓ，ｍｅｄｉｕｍ，ａｎｔｉ－ｂｒｏｗｎｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢ５ｍｅｄｉｕｍｃｏｕｌｄｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅｅｘｐｌａｎｔｓｆｒｏｍｂｒｏｗｎｉｎｇｗｅｌｌｗｈｉｌｅｂｒｏｗｎｉｎｇｗａｓｓｅｒｉｏｕｓｏｎＭＳｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｔｙｐｅｏｆｅｘｐｌａｎｔｐｌａｙｅｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｂｒｏｗｎｉｎｇ．Ｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｌａｔｅｒａｌｂｕｄｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌｂｕｄ；ａｎｄｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅｏｆｔｈｅｓｔｅｍｗｉｔｈｂｕｄｗａｓｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔ．Ｓｏａｋｉｎｇｅｘｐｌａｎｔｓｉｎ１ｇ／ＬＶＣｆｏｒ４ｈｃｏｕｌｄａｌｌｅｖｉａｔｅｂｒｏｗｎｉｎｇｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｒｏｗｎｉｎｇｃｏｕｌｄｂｅｒｅｓｔｒａｉｎｅｄｂｙａｄｄｉｎｇａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｎｄａｂｓｏｒｂｅｎｔａｔａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｎｉｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍＢ５＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｍｇ／ＬＩＢＡ．Ｔｈｅａｎｔｉ－ｂｒｏｗｎｉｎｇｅｆｆｅｃｔｒａｎｋｅｄａｓＰＶＰ＞ＶＣ＞ＡＣ． Lｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｄａｒｋｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｔｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｒｅｌｉｅｖｅｔｈｅｂｒｏｗｎｉｎｇｐｒｏｂｌｅｍ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈ；ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ； anti ｂｒｏｗｎｉｎｇ

天女木兰（ＭａｇｎｏｌｉａｓｉｅｂｏｌｄｉｉＫ．Ｋｏｃｈ）又名天女花、小花木兰，为木兰科木兰属落叶小乔木，是第四纪冰川时期幸存的珍稀植物，是国家重点保护的易危植物和吉林省一级保护植物［１］，也是中国惟一分布于东北地区的木兰科植物［２］。它集观叶、观花、观果于一身，同时全株含有芳香油，可以被用于提取高级香料并具有很高的药用价值。

目前，主要通过种子繁殖和扦插繁殖培育苗木，但种子繁殖存在采种难、生理休眠的问题，扦插繁殖存在生根慢及生根率低等问题［３－６］。运用组织培养技术是建立天女木兰无性繁殖的重要手段，不仅能有效解决种源欠缺的问题，而且还能保留母树的优良性状，快速繁育良种。已有一些学者开展了天女木兰的组织培养研究工作，但存在繁殖系数低、褐化及生根难等问题［７－９］。因此如何克服褐化成为天女木兰组织培养快速繁殖成功与否的关键之一，而关于天女木兰组织培养快速繁殖中的褐化问题研究较少。基于此，研究了外植体类型、外植体预处理方法、培养基类型、培养条件及抗褐化剂类型等对天女木兰组织培养过程中外植体褐化的影响，以期为天女木兰组织培养快速繁殖提供参考，对挽救和保护这个珍稀濒危树种也具有重要意义。

１材料与方法

１．１材料

试验材料为取自吉林市龙潭区江密峰苗圃的８年生的长势良好的天女木兰实生苗，分别在３、４月初剪取天女木兰当年生健壮的休眠枝条，在室内水培７～１０ｄ，待芽萌动膨大时再接种；在５～７月剪取天女木兰新萌发的幼嫩枝条做试验。

１．２方法

采用单因素试验，每个处理接１０瓶，重复３次。剪取带芽的茎段、顶芽和侧芽，放入洗洁精溶液中浸泡２０ｍｉｎ，再用流水冲洗２ｈ，然后在超净工作台上用体积分数为７５％的乙醇对其表面消毒３０ｓ，用无菌水冲洗２～３次，然后用１ｇ／ＬＨｇＣｌ２处理７～８ｍｉｎ，用无菌水冲洗５～６次。将０．５～１．０ｃｍ的芽或带芽的茎段分别接种到相应的培养基中。如无特殊说明，培养基中均附加３０ｇ／Ｌ蔗糖和６ｇ／Ｌ琼脂，灭菌前ｐＨ５．８，培养温度为２３ ℃，光照采用自然光。分别在接种的７、１５、３０ｄ观察褐化率和外植体生长情况，所有试验数据均是培养３０ｄ的统计结果。褐化率＝褐化外植体／接种外植体×１００％。

１．２．１不同培养基对天女木兰褐化的影响设６个处理，所有培养基均添加０．５ｇ／Ｌ６－ＢＡ和０．３ｇ／ＬＩＢＡ。这６个处理分别为：①以ＭＳ为基础培养基，附加８ｇ／Ｌ琼脂；②以１／２ＭＳ为基础培养基，附加８ｇ／Ｌ琼脂；③以Ｂ５为基础培养基，附加８ｇ／Ｌ琼脂；④以１／２Ｂ５为基础培养基，附加８ｇ／Ｌ琼脂；⑤以Ｂ５为基础培养基，附加７ｇ／Ｌ琼脂；⑥以Ｂ５为基础培养基，附加６ｇ／Ｌ琼脂。研究不同培养基对天女木兰褐化的影响。

１．２．２不同外植体对天女木兰褐化的影响春季分别采用顶芽、带芽的茎段、侧芽３种外植体接种于培养基Ｂ５＋０．５ｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｇ／ＬＩＢＡ。研究不同外植体对天女木兰褐化的影响。

１．２．３不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响在培养基Ｂ５＋０．５ｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｇ／ＬＩＢＡ中添加０．５、１．０、２．０ｇ／Ｌ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ），０．２５、０．５０、１．００ｇ／Ｌ维生素Ｃ（ＶＣ）和０．５、１．０、２．０ｇ／Ｌ活性炭（ＡＣ）。研究不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响。

１．２．４不同培养条件对天女木兰褐化的影响设计３种培养条件：①接种后于１５ ℃暗培养７ｄ，转入２３ ℃于光下培养；②接种后于２３ ℃暗培养７ｄ，转入２３ ℃于光下培养；③接种后于２３ ℃光照培养，光照时间１２ｈ／ｄ，７ｄ后在２３ ℃、光照时间１２ｈ／ｄ、光照度２０００～２５００ｌｘ的培养室中继续培养。研究不同培养条件对天女木兰褐化的影响。

１．２．５不同外植体预处理方法对天女木兰褐化的影响将天女木兰侧芽分别在１ｇ／ＬＰＶＰ、１ｇ／ＬＶＣ以及清水中浸泡４ｈ，然后接种到培养基Ｂ５＋０．５ｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｇ／ＬＩＢＡ上。研究不同外植体预处理方法对天女木兰褐化的影响。

２结果与分析

２．１不同培养基对天女木兰褐化的影响

从表１可知，培养基对外植体褐化和生长有明显的影响。在６种培养基中，Ｂ５培养基对防止外植体褐化效果好，ＭＳ培养基中外植体褐化最为严重，褐化率达９０％。这可能是因为ＭＳ培养基中无机盐浓度过高，尤其是ＮＨ４＋浓度高，易引起酚类物质的大量产生，而盐浓度过高又会增加酶的活性，酶进一步促进酚类物质的合成与氧化，从而导致外植体的褐化。固体培养基中琼脂浓度不同即培养基硬度不同，抑制褐化的效果有一定差异。培养基较稀时，酚类、醌类物质容易渗入培养基，使培养基变为褐色，同时使接触它的外植体也变为褐色，褐化严重；培养基硬度较高时，培养基基本不变色，外植体大多成绿色，褐化较轻。

２．２不同外植体对天女木兰褐化的影响

外植体的取材部位与天女木兰的褐化程度密切相关。从表２可知，侧芽褐化率相对较低，为４０．０％；其次是顶芽，褐化率为４６．７％；带芽的茎段褐化率最高，为６３．３％，且出现褐化的时间早。可能是由于茎段切口面积大，使植物体内酚类物质大量流出，在多酚氧化酶（PPO）的作用下发生了氧化，使外植体易发生褐变。顶芽和侧芽的褐化发生情况不同，可能是由于位置效应影响了植物的生理状态，顶芽的物质代谢活跃，同时又由于不同位置内源激素浓度不同，致使基因的表达不一致，从而形成不同的生长状态。

２．３不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响

在培养基Ｂ５＋０．５ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ＋０．３ｍｇ／ＬＩＢＡ中添加适宜浓度的抗氧化剂、吸附剂等抗褐化剂有利于抑制天女木兰的褐化。由表３可知，抗褐化效果是ＰＶＰ＞ＶＣ＞ＡＣ，其中吸附剂ＰＶＰ控制褐化的效果最好，且随着ＰＶＰ浓度的升高，褐化率降低，试验得出添加１．０ｇ／ＬＰＶＰ时褐化率最低，为１０．０％，且外植体生长良好。抗氧化剂ＶＣ和吸附剂ＡＣ也能控制天女木兰的褐化，随着它们浓度的升高，褐化率均降低，但浓度过高会影响外植体的生长；ＶＣ浓度须控制在０．５０ｇ／Ｌ以下，且随培养时间的延长褐化明显加重，须及时转瓶；ＡＣ的抗褐化作用不明显，但ＡＣ作为一种无选择性的吸附剂，在吸附培养基中有害物质的同时还会吸附植物生长所需的营养物质，当其浓度达到２．０ｇ／Ｌ时，虽然褐化减轻但严重阻碍了外植体的生长。

２．４不同培养条件对天女木兰褐化的影响

从表４可知，培养初期一定的低温和暗培养可以减轻天女木兰的褐化程度，这可能与低温和黑暗条件抑制了酶的活性和减少了酚类物质的氧化有关。暗培养对减轻褐化效果较明显，而低温对其影响不大。酚类物质在合成和氧化过程中，需要许多酶的参与，其中有一部分酶的活性是受光诱导的，如ＰＰＯ在光照条件下活性提高。因此，暗培养可以抑制酶活性，从而减轻天女木兰外植体的褐化程度。在试验中发现，随着培养时间的延长，褐化现象也随即产生，说明低温和暗培养只能在短时间内抑制了褐化物质的产生。

２．５不同外植体预处理对天女木兰褐化的影响

天女木兰芽在接种前采用抗褐化剂浸泡４ｈ，对抑制褐化有一定作用（表５）。两种药剂处理的褐化率均低于对照（清水）。用１ｇ／ＬＶＣ处理效果较好，褐化率为２０．０％，外植体长势好；用１ｇ／ＬＰＶＰ处理的褐化率为３６．７％。

３小结与讨论

选择适宜的外植体是控制天女木兰褐化的有效手段。因为不同部位和生理状态的外植体中酚类物质的含量及多酚氧化酶（PPO）的活性存在差异。研究得出，以天女木兰侧芽为外植体，褐化程度较轻。这一结果和徐石等［９］的研究结果一致。

适宜的取材时间可减轻天女木兰的褐化程度。由于在春季，天女木兰植株体内代谢活动较弱，其细胞内参与氧化反应的PPO活性较低，因此，在这个季节取材褐化率较低；将取材时间设置为１２月至次年３月的冬芽萌动时期，在一定程度上减少了星花木兰等植株褐化的损失［１０］。周丽艳等［１１］在白玉兰组织培养的褐化控制研究中也得出了同样的结论。

培养基中添加抗氧化剂、吸附剂可减轻天女木兰的褐化程度。研究得出，聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ）的抗褐化效果最好，其次是维生素Ｃ（ＶＣ），再次是活性炭（ＡＣ）。刘均利等［１２］在木兰科华盖木组织培养的褐化控制研究中也得出了同样的结论。添加１ｇ／Ｌ

ＰＶＰ，褐化率最低，为１０．０％，且促进了外植体生长。随着抗褐化剂浓度的升高，褐化情况有所缓解，但浓度过高会影响外植体生长，因此抗褐化剂的使用浓度要适中。而吸附剂则可吸附分泌到培养基中的酚类、醌类物质，有效地防止此类物质所诱发的褐变。

适宜的培养基可减轻天女木兰的褐化程度。研究得出，Ｂ５培养基防止外植体褐化的效果最好。ＭＳ培养基抑制褐化效果最差，不适合作为天女木兰组织培养的培养基。不同培养基中盐离子浓度差异较大，而盐浓度过高会增加酶的活性，酶又进一步促进酚类物质的合成与氧化；同时无机盐中的Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋参与酚类物质的合成，是氧化酶的组成成分或辅助因子，导致外植体的褐化。

适宜的培养条件能延缓天女木兰的褐化，这可能是黑暗和低温暂时降低了PPO的活性，在一定程度上降低了酚类物质的氧化，但一旦恢复到正常的培养状态，其活性也随即恢复，又继续进行。在试验过程中，天女木兰暗处理比光处理效果好，较高的培养温度和光照度能加速外植体褐化。

综上所述，以上单因素措施在一定程度上控制了天女木兰的褐化程度，为了更好地控制天女木兰的褐化程度，需要综合采取多种抗褐化措施。

参考文献：

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［４］陆秀君，王妮妮，李天来，等．不同浸种和催芽处理对天女木兰种子的催芽效果［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００８，３６（５）：１３５－１４０．

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［９］徐石，陆秀君，李天来．天女木兰组织培养中有效获得无菌外植体的研究［Ｊ］．西北林学院学报，２００８，２３（３）：１２７－１２９．