罗田板栗种质资源ＩＳＳＲ分子标记初步鉴定

程水源 袁红慧 程华 李琳玲 王燕 许锋 姜德志

摘要：试验以湖北省罗田县的１５个板栗主要栽培品种为材料，利用ＩＳＳＲ分子标记对１５个板栗品种进行初步认证及亲缘关系分析。结果表明，从３５条ＩＳＳＲ引物中筛选出１７条能够扩增出清晰、稳定条带的引物；１７条引物共扩增出３９２条带，其中多态性条带有３４４条，多态性条带比率为８７．８％。应用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ软件进行ＵＰＧＭＡ法聚类分析，１５个板栗品种大致被分为三类。其中普通八月红和特殊八月红基本无遗传差异，玫瑰红与乌壳栗，六月暴和桂花香亲缘关系较近。初步鉴定结果可为板栗品种鉴别、分类及种质资源的有效利用提供理论依据。

关键词：罗田板栗；ＩＳＳＲ标记；品种鉴定

中图分类号：Ｓ６６４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3096-05

Ａ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｌｕｏｔｉａｎ Ｃｈｅｓｔｎｕｔ bｙ

ＩＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ

ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ－ｙｕａｎ１，２，ＹＵＡＮ Ｈｏｎｇ－ｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ１，２，ＬＩ Ｌｉｎ－ｌｉｎｇ１，２，ＷＡＮＧ Ｙａｎ１，ＸＵ Ｆｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，２

（１． Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Sｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ １５ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｌｕｏｔｉａｎ ｃｏｕｎｔｙ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ （ＩＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １７ ｐｒｏｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｒｉｃｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ３５ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅｓｅ １７ ｐｒｉｍｅｒｓ， a total of 392 bands were amplified from ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡｓ ｏｆ ｔｈｅ １５ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， among ｗｈｉｃｈ ３４４ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｎｄｓ， with a ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ of ８７．８％． １５ Ｌｕｏｔｉａｎ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ｂｙ ＵＰＧＭＡ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｎｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ Bａｙｕｅｈｏｎｇ ａｎｄ ｓｐｅｃｉａｌ Bａｙｕｅｈｏｎｇ， ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Mｅｉｇｕｉｈｏｎｇ ａｎｄ Wｕｋｅｌｉ， Lｉｕｙｕｅｂａｏ ａｎｄ Gｕｉｈｕａｘｉａｎｇ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｃｌｏｓｅ ｔｏ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｓｔｎｕｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｕｏｔｉａｎ cｈｅｓｔｎｕｔ； ＩＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ； ｖａｒｉｅｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ Ｂｌｕｍｅ）俗称栗子，又名瑰栗、毛栗、风栗，是壳斗科栗属的植物，落叶乔木。我国板栗栽培历史悠久，种质资源丰富，在复杂的地理条件和气候条件下，形成许多生态类型和地方品种［1］，河北、山东、湖北（罗田、麻城、大悟）、河南罗山、陕南镇安等地均是板栗著名的产区，其中尤以湖北罗田板栗最为著称。罗田栽培板栗品种多样，其中玫瑰红、浅刺大板栗、六月暴、乌壳栗、白毛早、红毛早、青毛早等品种栽培甚为广泛，对这些品种的划分传统方法主要依据板栗的形态特征、生物学特性等来鉴别，但在实际生产中对形态相似的品种仅依靠形态特征难以在苗木期就准确鉴别，且木本植物结实周期长，因而不利于优良品种的生产、推广和种质资源保存。如何准确鉴别品种，及时对新品种予以审定、注册、保护，建立准确可靠的品种特异性检测方法，对提高板栗的经济效益具有非常重要的实际价值［2］。

ＩＳＳＲ标记是近几年在微卫星分子标记基础上发展起来的一种新型分子标记技术［3］，与其他分子标记如ＡＦＬＰ、ＲＦＬＰｓ、ＳＳＲｓ、ＲＡＰＤ相比，具有多态性高、稳定性好、操作简便、费用低等优点。ＩＳＳＲ标记能有效揭示种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构及其多样性程度［4］。因此，ＩＳＳＲ标记技术在园艺植物种质资源研究、遗传关系分析、变异品种鉴定等方面具有广泛应用［5－9］。

目前，ＩＳＳＲ分子标记在板栗中的应用研究报道并不多见，仅见艾呈祥等［１0］采用ＩＳＳＲ分子标记对山东省内１０个板栗居群的２９７个个体的遗传多样性水平及居群遗传结构进行了研究；韩继成等［１1］通过优化的ＩＳＳＲ反应体系对河北省板栗生态型进行分析，以确定河北省板栗居群的遗传多样性。

本研究选用ＩＳＳＲ技术来探讨罗田板栗种质资源概况，以期能够更快速、准确、方便地获得板栗种质资源的遗传信息，从分子水平上为板栗种质资源的丰富和发展提供参考依据。

１材料与方法

１．１试验材料

１．１．１植物材料试验材料为湖北省罗田县板栗产区的１５个栽培品种，每个品种随机选取１０～２０片幼嫩叶片装入做好标记的袋中，于－４０ ℃冰箱中冷冻保存。材料来源和编号见表１。

１．１．２主要试剂琼脂糖、５×ＴＢＥ缓冲液、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自北京天根生化科技有限公司；Ｍａｋｅｒ ＤＬ ２０００购自宝生物工程（大连）有限公司；ＣＴＡＢ ＤＮＡ提取试剂盒、３０％聚丙烯酰胺、过硫酸胺、ＴＥＭＥＤ、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸等，购自武汉贝尔生物技术有限公司。

１．２试验方法

１．２．１板栗基因组ＤＮＡ的提取与检测本试验参考魏春红［１2］、程丽莉等［１3］的ＣＴＡＢ提取法略作改进，提取１５个板栗品种叶片的总基因组ＤＮＡ。０．８％琼脂糖凝胶电泳检测提取的ＤＮＡ质量，紫外分光光度计检测ＤＮＡ浓度，提取的总ＤＮＡ于－２０ ℃保存，备用。

１．２．２引物来源及ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应体系的建立试验所用引物是依据板栗ＥＳＴ文库，筛选出ＳＳＲ序列，参照加拿大哥伦比亚大学网站公布的ＩＳＳＲ引物序列，共设计出３５条扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应体系为３０ μＬ： ２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ反应液（０．１ Ｕ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ、５００ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ 及稳定剂和增强剂）１５ μＬ，引物３ μＬ，ＤＮＡ模板５０ ｎｇ，ｄｄＨ２Ｏ ９ μＬ。反应程序设为：９４ ℃预变性４ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，４１～５５ ℃退火４０ ｓ（具体参考表２），７２ ℃ ３ ｍｉｎ，共３５个循环； ７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

１．２．３引物筛选选用基因组ＤＮＡ纯度较高的板栗样品为模板，分别对３５个引物采用以上扩增程序进行ＰＣＲ扩增。扩增产物先用０．８％的琼脂糖凝胶电泳初步检测，再用６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析，筛选出多态性较高的引物用于１５个板栗样品的鉴定。

１．２．４数据统计与分析将选扩的ＰＣＲ产物用６％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，在９０Ｖ电压下电泳约５０ ｍｉｎ，经硝酸银染色，氢氧化钠显影，所获得的扩增条带以０、１统计建立数据库。条带统计以其清晰可重复为基本原则，采用人工读带法，在相同迁移位置，有带记为１，无带记为０。在ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ分析软件中，根据ＳＭ相似系数法求得品种间的遗传相似性矩阵，再用ＵＰＧＭＡ进行聚类分析，构建系统进化树［１4］。

２结果与分析

２．１引物筛选结果

随机选取普通八月红、北丰羊毛栗２个品种的ＤＮＡ为模板，分别对３５条ＩＳＳＲ扩增引物进行筛选，淘汰无扩增产物和多态性差的引物，选留扩增条带清晰且有明显多态性片段的引物。根据0.8%的琼脂糖电泳得到的初步检测结果（图１），结合6%的聚丙烯酰胺电泳（图２）的进一步分析，从中筛选出了１７个引物（表２）。这些引物均能在供试板栗中扩增出清晰、稳定、重复性和多态性较高的条带。

图１结果显示，在泳道１～７、９～１２、１４～１７、２４～２６、３１、３３～３５中均有多态性条带，说明对应编号的引物都可为ＩＳＳＲ引物筛选提供参考。对其他泳道没有显示多态性条带的引物予以淘汰。

由图２聚丙烯酰胺电泳检测结果分析知，泳道１～７、１０～１２、１５～１７、２４～２６、３１、３３、３４多态性条带数清晰且条带数均在６条以上，再结合图１初步筛选的结果确定了以下１７条引物（表２）用于罗田１５个板栗栽培品种的认证和鉴定。

２．２ＩＳＳＲ多态性分析及指纹分析

用筛选出的１７个引物分别对１５个罗田板栗栽培品种ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，经统计共扩增出３９２条ＤＮＡ带，其中多态性条带３４４条，平均每个引物扩增出２３．１条带，平均多态性位点百分率为８７．８％，具体扩增结果见表２。不同引物扩增出的条带数有较大差异，引物Ｌ１２、Ｌ１扩增出的条带较多，分别为３１、３０条；引物Ｌ２４扩增出的条带数最少，为１２条。引物多态性达９０％以上的有Ｌ１、Ｌ２、Ｌ６、Ｌ１１、Ｌ１７、Ｌ２４、Ｌ３３共７个，其中引物Ｌ２的多态性最高，为１００％。１７条引物分别建立了相应的ＤＮＡ指纹图谱，由各引物扩增效果所反应出的ＤＮＡ条带多态性，能较好地区分开各板栗品种。

２．３板栗品种间的遗传相似性分析

用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ软件计算板栗品种间的Ｄｉｃｅ遗传相似系数（见表３）。由表３可知，１５个板栗品种间的遗传相似系数范围为０．５３～０．９７，平均遗传相似性系数为０．６７。结果显示普通八月红与特殊八月红遗传相似性系数最大，为０．９７，说明这两个品种亲缘关系很近，有可能为同一品种。其次是玫瑰红与乌壳栗、六月暴与桂花香，相似性系数分别为０．８９、０．８７，表明它们之间的亲缘关系很接近，遗传差异较小。而普通八月红与处暑红、白毛早与特殊八月红、特殊八月红与处暑红之间均具有最小遗传相似性系数，为０．５３，可见它们遗传差异比较大，两两品种间的亲缘关系较远。

２．４聚类分析

在获得两两不同品种间的Ｄｉｃｅ遗传相似系数基础上，以３４４个位点的谱带为原矩阵，采用ＵＰＧＭＡ法构建了15个板栗品种间的系统进化树（图３）。树状图与品种间的遗传相似系数反应的情况基本一致，即遗传相似系数越高，亲缘关系越近，品种间差异就越小。从图3可以看出，在相似性系数０．５９处，１５个品种资源划分成Ａ、Ｂ两支，Ｂ群由白毛早和处暑红构成，两品种间的相似系数为０．６５。其余１３个品种聚为Ａ群，在相似系数０．６５处Ａ群分为Ａ１和Ａ２两个亚群。Ａ１亚群包括普通八月红、特殊八月红、胜利羊毛栗早熟、浅刺大板栗和中果早栗，在遗传相似系数０．６９处，５个品种又被聚为两个小类群，前３个为一个小类群，其中以普通八月红与特殊八月红相似性系数最高，而胜利羊毛栗早熟也可与它们归为一类，从１５个品种的１７个ＩＳＳＲ指纹图谱中也可以明显看出，这３个品种的指纹图谱非常接近。浅刺大板栗和中果早栗则聚为第二个小类群，两者的遗传相似系数为０．７８。