三种寡核苷酸纯化方法的比较

摘要：分别采用固相萃取法、电泳法、色谱法纯化寡核苷酸，色谱分析结果表明产物纯度高，固相萃取法纯化后的产物纯度低于电泳法与色谱法，但产量相对较大，ＰＣＲ检测结果证明３种方法纯化的寡核苷酸具有良好的检测性能。在建立的固相萃取纯化试验条件下，对３种填料纯化寡核苷酸的效果、产量、成本进行了比较分析，结果表明，使用硅胶Ｃ１８和聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）填充的萃取小柱既能达到良好的纯化效果又可降低成本。

关键词：寡核苷酸；纯化；固相萃取；电泳；色谱

中图分类号：ＴＱ４６４．６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3065-05

Comparison of Three Purification Methods for Oligonucleotides

ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ

(Textile and Chemical Engineering College, Binzhou Polytechnic, Binzhou 256603, Shandong, China)

Ａｂsｔｒａｃｔ： Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｕｒｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｒｏｍ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａ ｌｉｔｔｌｅ ｂｉｔ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｂｕｔ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｒ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＰＣＲ ｔｅｓｔ， ａｌｌ ｔｈｅ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ， ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｃｏｓｔ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ with ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ Ｃ１８ ａｎｄ ＰＳ／ＤＶＢ ｆｉｌｌｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ； ｐｕｒｉｆｙ； ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

寡核苷酸是由核苷酸通过３′，５′－磷酸二酯键连接而成的短链ＤＮＡ分子。它可作为ＰＣＲ检测所需要的引物或探针的主要组成部分，广泛应用于生物学、农牧业、医学等领域［１－３］。目前，中国已可使用ＤＮＡ合成仪快速合成各种序列的寡核苷酸以及荧光标记的寡核苷酸，最常用的寡核苷酸为１０～３０ ｎｔ。以链长为２５ ｎｔ的寡核苷酸为例，产物纯度约为８０％～８５％，其中含有一定量的杂质，如５′羟基不完全脱二甲氧基三苯甲烷（ＤＭＴ）保护基团或不完全封闭羟基产生的非目标序列等。这些杂质不但造成寡核苷酸定量不准，还可能影响到下一步的生物学试验。因此，合成后的寡核苷酸需要纯化。目前大多采用的寡核苷酸纯化方法有３种，分别为固相萃取法［４］、电泳法和色谱法。

研究采用美国应用生物系统公司的ＤＮＡ合成仪合成寡核苷酸，分别采用３种方法在优化的试验条件下进行纯化，比较纯化效果；再应用制备的寡核苷酸作为ＰＣＲ检测用引物，成功地从南瓜果实中检测到了黄瓜绿斑驳花叶病毒［５］；另外，对固相萃取法和色谱法纯化寡核苷酸进行了具体的研究。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料聚苯乙烯－二乙烯基苯填料（ＰＳ／ＤＶＢ）（粒度５０ μｍ）、ＹＭＣ*ＧＥＬ ＯＤＳ－Ａ制备色谱球形填料／硅胶Ｃ１８（平均孔径１２ ｎｍ，粒度５０ μｍ）购自北京慧德易科技有限责任公司，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱（货号ＷＡＴ０９４２２６）、ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０.0 ｍｍ×４．６ ｍｍ，平均孔径１４ ｎｍ，粒度２．５ μｍ）购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司，筛板、６ ｍＬ萃取柱购自大连思谱精工有限公司，荧光薄层层析板购自青岛海洋化工厂，寡核苷酸购自中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所。

１．１．２试剂三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、溴酚蓝、二甲苯蓝、过硫酸铵（ＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、冰醋酸、三乙胺、乙腈、尿素、三氟乙酸、浓氨水等，以上均为分析纯。

１．１．３主要仪器高效液相色谱仪（包括６００泵、６００控制器、７１７自动进样器、２９９６光电二极管矩阵检测器）、固相萃取装置购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司，ＤＹＹ－１０Ｃ电泳仪、ＷＤ９４０３Ｅ手提式紫外灯购自北京市六一仪器厂，ＤＵ６４０核酸蛋白分析仪购自美国ＢＥＣＫＭＡＮ公司，ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００实时荧光ＰＣＲ仪购自美国ＡＢＩ公司，ＰＴＣ－２００梯度ＰＣＲ仪购自美国ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ公司。

１．２方法

１．２．１固相萃取纯化取筛板置于６ ｍＬ萃取柱底端，分别称量１００ ｍｇ的硅胶Ｃ１８、ＰＳ／ＤＶＢ填充萃取柱，平铺填料后，在其上面放一个筛板。以一定序列的带ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式）为试验样品，用３ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ醋酸三乙胺（ＴＥＡＡｃ）溶液溶解样品，振匀后平均分成３份，分别使用Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ固相萃取小柱、自组装的ＰＳ／ＤＶＢ和硅胶Ｃ１８萃取小柱纯化寡核苷酸，方法如下：将４ ｍＬ乙腈过柱，活化；用４ ｍＬ ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液进行柱平衡；上样，３～４ ｍｉｎ内样品在重力下通过吸附床，重复两次上样；用３ ｍＬ含体积分数为１４％的乙腈的ｐＨ ８的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液冲洗短链的寡核苷酸，重复一遍；用３ ｍＬ去离子水洗两遍；将３ ｍＬ体积分数为３％的三氟乙酸加入到填料上方，其在重力下过柱，控制旋钮，先流出１ ｍＬ的三氟乙酸，停３～５ ｍｉｎ，完成去ＤＭＴ保护基团过程，观察到吸附层变橙红色后再重复用３ ｍＬ的三氟乙酸过柱；用３ ｍＬ去离子水洗两遍；逐滴加入１ ｍＬ含体积分数为１０％的乙腈的ｐＨ １１．３的０．３６ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液，控制流速为１～２ ｍＬ／ｍｉｎ，边洗脱边收集。定量，分装，干燥。

１．２．２电泳纯化

1）电泳。在５０ ｍＬ的１６％聚丙烯酰胺凝胶溶液中加２５０ μＬ ＡＰＳ溶液、３７．５ μＬ ＴＥＭＥＤ，迅速搅拌均匀后，倒入两玻璃板间，插入样梳，静置４０～１２０ ｍｉｎ，凝固后拔掉样梳。接通电源，设定电压为６００ Ｖ，电泳前预热３０ ｍｉｎ。用２００ μＬ饱和尿素溶解样品，上样；用含溴酚蓝、二甲苯蓝的饱和尿素溶液作为指示剂，在６００ Ｖ电压下电泳，溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿１／３处停止电泳。

2）引物回收。用塑料镊子启开玻璃板，小心将胶置于铺有塑料薄膜的荧光薄层层析板上。用２６０ ｎｍ波长的紫外光从上方照射凝胶，用刀片切下含有目的条带的凝胶。采用浸泡法从凝胶中回收寡核苷酸，将切下来的凝胶移入１．５ ｍＬ离心管中，挤碎，将破碎的凝胶置于加有５ ｍＬ灭菌水的１０ ｍＬ离心管中，于３７ ℃摇床中温育过夜。离心，取上清液，干燥。

3）脱盐。使用自组装的硅胶Ｃ１８萃取小柱脱盐，步骤如下：将４ ｍＬ乙腈过柱，活化；将４ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液过柱，使柱平衡；用１ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液溶解样品，上样；将４ ｍＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液过柱；将４ ｍＬ去离子水过柱，脱盐；最后用１ ｍＬ体积分数为７０％的乙腈洗脱样品。

4）定量、分装、干燥。

１．２．３色谱纯化流动相由ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液和乙腈溶剂组成。柱温为６０ ℃，流速为１ ｍＬ／ｍｉｎ，色谱柱为ＸＴｅｒｒａＴＭ ＭＳ Ｃ１８柱（５０．０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，粒度２．５ μｍ，平均孔径１４ ｎｍ）。采用２５４ ｎｍ和２９０ ｎｍ双波长检测。

１）ＤＮＡ（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式）的色谱纯化。对于未选择“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成（即合成的寡核苷酸不带ＤＭＴ保护基团），用浓氨水释放寡核苷酸后离心、干燥，然后采用反相离子对色谱法进行纯化，纯化后不需要去ＤＭＴ保护基团，直接定量。

用２００ μＬ ｐＨ ７的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＴＥＡＡｃ溶液溶解样品，上样，检测波长为２５４、２９０ ｎｍ，当检测到目标产物峰时，人工收集目标产物。色谱条件见表１。用色谱纯化后干燥；再用硅胶Ｃ１８萃取小柱脱盐，定量，分装，干燥。

２）ＤＮＡ（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式）的色谱纯化。对于选择“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成（即全长寡核苷酸的最后一个核苷酸保留ＤＭＴ保护基团），用浓氨水释放寡核苷酸后，离心、干燥；然后采用反相离子对色谱法进行纯化，色谱条件见表２；用色谱纯化后干燥；用体积分数为８０％的冰醋酸去ＤＭＴ保护基团，静置２０～３０ ｍｉｎ，干燥；用硅胶Ｃ１８萃取小柱脱盐，定量，分装，干燥。

２结果与分析

２．１色谱分析

２．１．１固相萃取纯化结果分析采用表１中的色谱条件对３种小柱纯化寡核苷酸后的产物进行纯度分析，在２６０ ｎｍ波长下，当吸光度为１时寡核苷酸浓度约为３０ μｇ／ｍＬ［６］，应用ＤＵ６４０核酸蛋白分析仪测定适当稀释后的寡核苷酸的吸光度，再根据稀释倍数和体积计算出纯化后寡核苷酸的产量。由图１Ａ、图１Ｂ、图１Ｃ以及表３可知，在建立的试验条件下，采用３种填料固相萃取纯化的寡核苷酸都有少量杂质，但是都比较纯而且产量相近。因此，该试验条件适用于采用硅胶Ｃ１８、ＰＳ／ＤＶＢ纯化寡核苷酸；固相萃取纯化是个非常粗糙的过程，由于ＤＭＴ保护基团具有强疏水性以及短链寡核苷酸的合成效率高，使得不同填料固相萃取纯化的效果相差不大，采用３种填料纯化后的寡核苷酸纯度都很高。

２．１．２电泳纯化结果分析电泳法纯化一定序列的寡核苷酸（“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式）后，按照表１的色谱条件，在波长２５４ ｎｍ下检测纯化后的产物。从图２可知，杂质峰几乎看不到，可知电泳纯化的寡核苷酸纯度高。

２．１．３色谱纯化结果分析由图３可知，应用表１的色谱条件能够将不带强疏水性ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸与杂质分离，通过２５４和２９０ ｎｍ双波长检测到在８～１１ ｍｉｎ出来的色谱峰在双波长检测下吸光度最大，且峰面积最大，所以初步被判断为目标产物。收集后，在相同色谱条件下分析，图４中仅在10～１2 ｍｉｎ出现惟一色谱峰，说明在该色谱条件下能很好地纯化不带强疏水性ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸。由图５可知，在表１的色谱条件下分离２０ μＬ带有ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸，在梯度洗脱前２０ ｍｉｎ内目标寡核苷酸没有分离出来，而是在２０ ｍｉｎ后，目标寡核苷酸、部分杂质由强非极性溶剂１００％乙腈一同洗脱出来，试验证明，由于ＤＭＴ基团具有强疏水性，在反相离子对色谱柱中具有强保留性，因此表１中色谱条件不适用于分离具有ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸，须用非极性更强的流动相洗脱。所以，采取增加流动相Ｂ的非极性的办法改进色谱条件，将流动相Ｂ中的乙腈体积分数由１５％增加至４０％，依据公式Ｔ＝△φ／ｔＧ（Ｔ为梯度陡度，△φ为流动相中强洗脱液组分Ｂ体积分数的变化值，ｔＧ为梯度洗脱时间）计算梯度陡度（Ｔ），Ｔ减少到了１．１％／ｍｉｎ，从而保证了流动相Ｂ在梯度洗脱时间内保持较强的非极性。由图６可知，在２５４和２９０ ｎｍ双波长检测下，根据吸光度和峰面积判断目标产物在１４～２０ ｍｉｎ分离出来，收集后，在同样色谱条件下分析，图７在１４～２０ ｍｉｎ出现了惟一一个色谱峰，无杂质峰，说明在表２的色谱条件下，能够很好地分离带有强疏水性ＤＭＴ保护基团的寡核苷酸。

２．２性能检测试验结果

将固相萃取、电泳及色谱纯化后的寡核苷酸用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的ＲＴ－ＰＣＲ及实时荧光ＰＣＲ检测，考察其检测效果。由图８可知，对于黄瓜绿斑驳花叶病毒的ＲＴ－ＰＣＲ试验，以纯化后的一定序列的寡核苷酸作为引物进行ＰＣＲ扩增，电泳结果表明３个泳道均在近７５０ ｂｐ位置出现了扩增条带。由图９可知，将纯化后的一定序列的寡核苷酸作为实时荧光ＰＣＲ检测用引物，得到了实时荧光ＰＣＲ扩增曲线，检测到了南瓜果实中的黄瓜绿斑驳花叶病毒。说明采用３种方法纯化的寡核苷酸纯度高，适用于ＰＣＲ检测。

２．３产量比较试验结果

应用ＤＮＡ合成仪，以０．２ μｍｏｌ合成规模合成一定数量不同序列的２０ ｎｔ左右的寡核苷酸，应用此次研究建立的纯化条件，通过多次试验，总结出固相萃取纯化的平均产量为６００～９００ μｇ；色谱纯化的平均产量为３００～４５０ μｇ；电泳纯化的平均产量为３００～４５０ μｇ。

３小结与讨论

１）固相萃取纯化寡核苷酸试验中，３种填料纯化的产物浓度都较高且产量相差不大。３种填料各有优缺点，从耐酸碱、耐用性方面比较，硅胶Ｃ１８不耐酸碱，工作ｐＨ ２～７，而聚苯乙烯－二乙烯基苯（ＰＳ／ＤＶＢ）的工作范围为ｐＨ（工作／清洗）２～１３／１～１４，耐强酸强碱，可重复使用。虽然理论上，在ｐＨ ７．５以上键合硅胶填料的硅基体在水溶液中易于溶解；在ｐＨ ２．０以下硅醚链不稳定并且表面上的官能团开始裂开，改变了吸附性能。然而，由于填料暴露于溶剂的时间很短，若一次使用，硅胶Ｃ１８的稳定性是可以接受的。从价格上比较，Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ＞ＰＳ／ＤＶＢ＞硅胶Ｃ１８。综合以上的分析可知，采用固相萃取法，一次性使用自组装的硅胶Ｃ１８或重复使用ＰＳ／ＤＶＢ萃取小柱可达到良好的纯化效果，并且降低了成本。

２）对于带有ＤＭＴ基团的寡核苷酸的纯化，由于寡核苷酸的ＤＭＴ保护基团的强疏水作用，纯化时需要用强非极性的洗脱液洗脱。寡核苷酸在合成时设置“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式较合适，这是因为在日常寡核苷酸生产中，合成的序列是变化的，难以采用标准物对照进行色谱定性。若为“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｆｆ”形式的合成，在合成产物效率高时，根据峰面积可以判断出目标产物峰；但在合成效率不高时，由于没有明显大面积的色谱峰，导致无法判断哪个峰是目标产物。而对于“Ｔｒｉｔｙｌ ｏｎ”形式的合成，由于全长的寡核苷酸带有强疏水性的ＤＭＴ保护基团，保留时间长，与其他杂质保留时间差异大，可根据保留时间长短及峰面积大小识别目标产物峰。

３）比较３种方法纯化产物的色谱分析结果，合成短片段寡核苷酸时，由于总的合成效率高，失败序列少，色谱分析结果证明采用固相萃取法、电泳法、色谱法纯化后的产物纯度相差不大，但也有差别，固相萃取纯化产物的色谱分析图中有少量的面积小的杂质峰，而电泳纯化和色谱纯化产物的色谱分析图中几乎没有杂质峰，这说明固相萃取法纯化产物的纯度低于电泳、色谱纯化的产物。比较３种方法纯化后产物的产量，固相萃取纯化的寡核苷酸的产量较高，而色谱纯化和电泳纯化的寡核苷酸的产量相近，纯度相对高。对于纯度要求高的ＰＣＲ克隆、点突变等分子生物学试验和修饰／标记的寡核苷酸，宜选择电泳法或色谱法纯化。

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