广西巴马小型猪氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析

严雪瑜 黄云 严小东 蒋钦杨 郭亚芬 蒋和生

摘要：采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析了广西巴马小型猪的氟烷基因类型。结果显示，ＰＣＲ扩增获得广西巴马小型猪氟烷基因片段长４５２ ｂｐ，其碱基序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的普通猪同源性为９９．６％；采用ＨｈａⅠ酶切检测广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪氟烷基因的ＰＣＲ产物，均产生２条电泳条带，未表现多态性；测序表明广西巴马小型猪氟烷基因第１ ８４３位碱基均为Ｃ。猪氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析技术为优质猪的培育提供了理论依据。

关键词：广西巴马小型猪；氟烷基因；ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

中图分类号：Ｓ８２８．８＋９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4144-03

Analysis on Halothane Gene in Guangxi Bama Mini-pig with PCR-RFLP

ＹＡＮ Ｘｕｅ－ｙｕ１，ＨＵＡＮＧ Ｙｕn１，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｄｏｎｇ２，ＪＩＡＮＧ Ｑｉｎｇ－ｙａｎｇ１，ＧＵＯ Ｙａ－ｆｅｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｈｅ－ｓｈｅｎｇ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４，Ｃｈｉｎａ；

２．Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ， Ｆａｎｇｃｈｅｎｇｇａｎｇ ５３８０２１，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ hａｌｏｔｈａｎｅ（Ｈａｌ） ｇｅｎｅ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ was ａｎａｌｙｓｉｚｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗａｓ ４５２ ｂｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ９９．６％ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ． Ｔｗｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｈｅｎ ｔｈｅｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇｓ， Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ×Ｌａｎｄｒａｃｅ ｃｒｏｓｓｂｒｅｄｓ ａｎｄ Ｌａｎｄｒａｃｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ＨｈａⅠ without ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ １８４３ｒｄ ｂａｓｅ ｏｆ ａｌｌ ｔｈｅ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ Ｃ． ＰＣＲ－ＲＦＬＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ Ｈａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｐｉｇ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂａｍａ ｍｉｎｉ－ｐｉｇ； hａｌｏｔｈａｎｅ ｇｅｎｅ； ＰＣＲ－ＲＦＬＰ

猪应激综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＳＳ）易导致猪应激而突然死亡或产生白肌肉，给养猪业造成巨大的经济损失。ＰＳＳ是由于氟烷基因（Ｈａｌｏｔｈａｎｅ，Ｈａｌ）或称骨骼肌兰尼定受体基因（Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ，ＲＹＲ１）突变所致，兰尼定受体基因ＣＤＳ序列的Ｃ１８４３→Ｔ１８４３突变致使受体蛋白的第６１５位的氨基酸发生变异（Ａｒｇ→Ｃｙｓ），引起蛋白结构和功能的改变；这种改变使猪在应激状态下肌肉组织中大量的Ｃａ２＋异常释放，引起血浆β－内啡呔过量分泌，电解质代谢出现紊乱，发生肌肉持续收缩，进而使猪产生恶性高热；肌肉组织收缩需要大量能量，氧化分解供能不足，需要依靠糖酵解来获得能量，致使乳酸产生过多，肌肉ｐＨ异常降低，出现ＰＳＥ肉［１］。内切酶ＨｈａⅠ能识别野生型ＨａｌＮ基因的５－ＧＣＧ↓Ｃ－３，即Ｃ１８４３位点，因此，可利用内切酶ＨｈａⅠ检测Ｃ１８４３→Ｔ１８４３突变位点来判断猪的应激敏感性。

不同猪种携带Ｈａｌｎ基因的频率不一样。文献报道我国地方猪种Ｈａｌｎ基因的频率为：二花脸猪０．５７％［２］、民猪１０％～１６．６７％［２-４］，而内江猪、版纳猪、五指山小耳猪、藏猪均为０［５］。广西巴马小型猪或称巴马香猪尚未见此类文献报道。巴马香猪主产于广西区巴马瑶族自治县，其以体型矮小，皮薄肉细，肉质鲜美而闻名于世。本试验研究建立氟烷基因ＰＣＲ－ＲＦＬＰ突变检测技术，为广西巴马小型猪的选育和资源合理开发利用提供科学依据。

１材料与方法

１．１试验动物

广西巴马小型猪来源于广西大学巴马小型猪原种场。长白猪和巴长二元杂猪来源于广西大学动物科学技术学院实习基地猪场。

１．２试验方法

１．２．１引物的设计与合成针对Ｈａｌ （ＲＹＲ１）基因内含子１６后端序列、外显子１７全部序列、内含子１７前端序列设计引物，其中Ｈａｌ基因 ＣＤＳ序列第１ ８４３位突变检测位点对应外显子１７的第１８ ６１８位点。引物序列为Ｐｒｉｍｅｒ（ｕｐ）：５′－ＧＡＧＴＧＧＡＧＴＣＴＣ

ＴＧＡＧＴＣＧＧ－３′；Ｐｒｉｍｅｒ（ｄｏｗｎ）：５′－ＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴ

ＧＣＴＧＡＴＧ－３′。

１．２．２基因组ＤＮＡ的提取猪血液总ＤＮＡ提取按照基因组ＤＮＡ提取试剂盒操作。

１．２．３ＰＣＲ反应ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ＭｇＣｌ２ １．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，Ｐｒｉｍｅｒｓ（ｕｐ，ｄｏｗｎ） ０．７ μＬ，Ｔａｑ酶 ０．３ μＬ，总ＤＮＡ模板５ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５ μＬ。

ＰＣＲ 反应程序：预变性９４ ℃，５ ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ ｓ，６１ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，３４个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，于４ ℃保存。

１．２．４克隆与测序将胶回收纯化克隆连接到ｐＭＤ－１８Ｔ 载体上，将重组质粒转化到ＤＨ５α大肠杆菌。经菌液ＰＣＲ鉴定、质粒酶切鉴定，重组阳性菌液送至英骏（上海）生物技术有限公司和深圳华大基因生物公司进行序列测定。

１．２．５ＰＣＲ－ＲＦＬＰ酶切鉴定采集广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪血样并提取基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增目的片段，用ＨｈａⅠ将ＰＣＲ产物在３７ ℃酶切４ ｈ，酶切产物用１％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

２结果与分析

２．１测序结果

测序结果显示，成功克隆了广西巴马小型猪氟烷基因的部分序列，长度为４５２ ｂｐ，包含内含子１６后端的２４５ ｂｐ，外显子１７的１３４ ｂｐ，内含子１７前端的７３ ｂｐ。在线Ｂｌａｓｔ同源比对表明，广西巴马小型猪氟烷基因序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的Ｚ４９７７８．１普通猪同源性为９９％，有２处碱基差异，均出现在内含子１６上。广西巴马小型猪Ｈａｌ基因部分序列比对结果如图１所示。

２．２ＰＣＲ－ＲＦＬＰ结果

由图２、图３、图４可知，广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪３种猪的ＰＣＲ产物经ＨｈａⅠ酶切，电泳均产生２条带，估计大小分别为１５７ ｂｐ和２９５ ｂｐ，未表现出多态性，没有检测到氟烷基因第１ ８４３位点突变，即试验猪群不携带Ｔ１８４３。

３讨论

３．１氟烷基因点突变的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析

氟烷基因编码序列第１ ８４３位碱基突变是引起猪应激综合征的主要诱因，对该位点的检测是判断猪是否易感ＰＳＳ的可靠途径。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术是利用限制性内切酶特异性剪切作用来鉴定目标碱基的突变类型，方法可靠、简单、快速。本研究对广西巴马小型猪、长白猪、巴长二元杂猪的Ｈａｌ基因进行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，结果表明广西巴马小型猪没有检测到Ｈａｌｎ基因，不会发生ＰＳＳ，与帅素容等［５］报道的结果相似。

３．２氟烷基因对猪肉品质的影响

氟烷基因是影响肉质的一个主效基因，是产生ＰＳＥ肉和ＤＦＤ肉的遗传基础［７］，因此，对Ｈａｌ基因型分析是杂交培育优良肉质猪的可靠依据之一。刘显军等［８］研究表明，ＨａｌＮＮ型猪肌肉Ｈａｒｔ透过率比ＨａｌＮｎ猪的高，而挥发性盐基氮含量要低些，这说明在屠宰后的鲜肉中，肌肉蛋白变性的速度前者比后者缓慢，形成劣质肉的可能性要小。肌肉Ｈａｒｔ透过率是评定肌肉蛋白变性程度的重要指标，一般认为，Ｈａｒｔ透过率越小，肌肉蛋白变性程度越大，肌肉保持水分的能力越小，劣质肉的发生概率增大。

３．３氟烷基因对猪繁殖性能的影响。

猪氟烷基因隐性突变对繁殖性能产生不良影响。蒋思文等［9］报道猪氟烷基因阴性（Ｈａｌｎｎ）比阳性（ＨａｌＮＮ）、杂合子（ＨａｌＮｎ）每窝产仔数和活仔数少２．０～２．７头，繁殖性能ＮＮ﹥Ｎｎ﹥ｎｎ。姜勋平等［１0］研究表明，携带ｎ等位基因可降低母猪的产仔数和仔猪成活率，对繁殖性能有不良的遗传效应。刘海峰等［１1］报道猪氟烷基因ＮＮ型个体３５日龄断奶成活率显著高于Ｎｎ型个体。鞠慧萍等［１2］报道，经产母猪ＮＮ型的总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数和初生窝重显著高于Ｎｎ型、ｎｎ型；张新银等［１3］研究表明，经产母猪产仔数和产活仔数在不同基因型间表现出ＮＮ＞Ｎｎ＞ｎｎ的趋势；携带有Ｈａｌｎｎ基因的母猪对应激高度敏感，受到应激后难以配种，怀孕后极易流产。

参考文献：

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［２］ 李来记，张沅，李宁．猪恶性高热综合征（ＭＨＳ）基因群体检测及部分片段ＤＮＡ序列研究［Ｊ］．中国畜牧兽医学报，１９９６，１６（６）：５４０－５４５．

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［７］ ＫＡＲＬＳＳＯＮ Ａ，ＥＳＳＥＮ－ＧＵＳＴＡＶＳＳＯＮ Ｂ，ＬＵＮＤＳＴＲＯＭ Ｋ．Ｍｕｓｃｌｅ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｈａｌｏｔｈａｎｅ－ｇｅｎｅ－ｆｒｅｅ ｐｉｇｓ ａｔ ｓｌａｕｇｈｔｅｒ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｍｅａｔ ｑｕａｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｍｅａｔ Ｓｃｉ，１９９４，３８（1）：９１－１０１．

［８］ 刘显军，陈静，边连全，等．氟烷基因对猪肉贮藏品质的影响［Ｊ］．中国畜牧杂志，２００９，４５（２３）：１８－１９．

［9］ 蒋思文，邓昌彦，熊远著，等．氟烷敏感性与繁殖性能关系的研究［Ｊ］．中国畜牧杂志，１９９５，３１（５）：２０－２１．

［１0］ 姜勋平，张牧，刘桂琼，等．猪ＲＹＲ１基因对繁殖性能的影响［Ｊ］．江苏农业研究，１９９９，２０（１）：４８－５１．

［１1］ 刘海峰，帅素容，李芳琼，等．猪氟烷基因对繁殖性能的影响初探［Ｊ］．畜禽业，２００３（９）：１０－１１．

［１2］ 鞠慧萍，伊萍，吴圣龙，等． 氟烷基因对母猪繁殖性能的影响［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生命科学版），２００６，２７（２）：８０－８２．

［１3］ 张新银，孙敬礼，武磊，等． 氟烷基因对母猪繁殖性能的影响［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（６）：３６０３，３６１７．

收稿日期：２０１２－０２－０６

基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻１０１００００５－１１）

作者简介：严雪瑜（１９８８－），女，广西防城港人，在读硕士研究生，研究方向为动物遗传育种，（电话）１５８０７７１１６４６（电子信箱）ｊｉａｎｇｑｉｎｙａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；

通讯作者，蒋钦杨，副教授。