鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析

2012-04-29李金平张浩吉梁详解蒲文珺李高强郭建超李国清

湖北农业科学 2012年18期

李金平张浩吉梁详解蒲文珺李高强郭建超李国清

摘要：以采自广东省佛山市的鸽蛔虫（Ａｓｃａｒｉｄｉａｃｏｌｕｍｂａｅ）为研究对象，利用保守引物ＢＤ１和ＢＤ２扩增鸽蛔虫基因组ＤＮＡ的ＩＴＳｒＤＮＡ片段，对扩增产物进行克隆和序列测定。结果成功扩增出大小为１０４５ｂｐ的ＩＴＳｒＤＮＡ序列。获得的鸽蛔虫的ＩＴＳｒＤＮＡ序列（ＡＣ００１、ＡＣ００２）的５．８ＳｒＤＮＡ与ＧｅｎＢａｎｋ收录的鸡蛔虫５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＪ００１５０８）相似性分别为９５．５％和９４．３％，而与澳大利亚鸽蛔虫５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＪ００１５０９）相似性分别为９６．８％和９５．５％。将获得的序列与蛔目不同科的代表性蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列进行比对和系统进化分析，结果表明鸽蛔虫与鸡蛔虫处于同一进化分支上，也表明ＩＴＳｒＤＮＡ是蛔虫分子鉴定的有效遗传标记，这对蛔虫分子分类学及分子流行病学的进一步研究打下了基础。

关键词：鸽蛔虫（Ａｓｃａｒｉｄｉａｃｏｌｕｍｂａｅ）；ＩＴＳｒＤＮＡ；序列分析；系统进化分析

中图分类号：Ｓ８５２．７３＋１；Ｑ７８５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4138-03

Clone and Sequence Analysis of ITS rDNA of Ascaridia columbae

ＬＩＪｉｎ－ｐｉｎｇ1，2，ＺＨＡＮＧＨａｏ－ｊｉ2，ＬＩＡＮＧＸｉａｎｇ－ｊｉｅ1，ＰＵＷｅｎ－ｊｕｎ2，ＬＩＧａｏ－ｑｉａｎｇ1，ＧＵＯＪｉａｎ－ｃｈａｏ1，ＬＩＧｕｏ－ｑｉｎｇ1

（１．College of Veterinary Medicine，ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒal Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ；

２．ＦｏｓｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ of Science and Technology，Ｆｏｓｈａｎ５２８２３１，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ）ｒＤＮＡｏｆｒｏｕｎｄｗｏｒｍ（Ascaridia columbae）ｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＦｏｓｈａｎ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲｕｓｉｎｇａｐａｉｒｏｆｃｏｎｓｅｒｖｅｄｐｒｉｍｅｒｓＢＤ１ａｎｄＢＤ２．Ｔｈｅｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｃｌｏｎｅｄ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗed ｔｈａｔｔｈｅＩＴＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡ. ｃｏｌｕｍｂａｅｗａｓ１０４５ｂｐ．Ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆ５．８ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＡ．ｃｏｌｕｍｂａｅ（ＡＣ００１，ＡＣ００２）ｔｏｔｈａｔｏｆＡ．ｇａｌｌｉ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＪ００１５０８）ｗａｓ９５．５％ａｎｄ９４．３％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ａｎｄｔｏｔｈａｔｏｆＡｕｓｔｒａｌｉａｎＡ．ｃｏｌｕｍｂａｅ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ，ＡＪ００１５０９）ｗａｓ９６．８％ａｎｄ９５．５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ５．８ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＡ．ｃｏｌｕｍｂａｅａｎｄｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓｐｅｃｉｅｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ families ｏｆＡｓｃａｒｉｄｉｄａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡ．ｇａｌｌｉａｎｄＡ．ｃｏｌｕｍｂａｅ were ｉｎｔｈｅｓａｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｂｒａｎｃｈ．ＩｔｗａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔＩＴＳｒＤＮＡｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｏｆＡｓｃａｒｉｄｉｄａ， which ｌａｙｅｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｘｏｎｏｍｉｃａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＡｓｃａｒｉｄｉｄａ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｓｃａｒｉｄｉａｃｏｌｕｍｂａｅ；ＩＴＳｒＤＮＡ；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ

鸽蛔虫（Ａｓｃａｒｉｄｉａｃｏｌｕｍｂａｅ）是禽蛔科禽蛔属的一种大型线虫，主要寄生于鸽、孔雀等的小肠，具有较广泛的地理分布。鸽感染了鸽蛔虫后的主要症状表现为食欲不振、精神沉郁、下痢、消瘦、贫血，直至衰竭死亡。幼鸽易感，成鸽感染后会导致消瘦、飞行力下降，对养鸽业的危害很大。

传统的蛔虫鉴定方法是依据虫体进行形态学鉴定，此法简单易行，鉴定成虫比较准确，但对于蛔虫的虫卵和幼虫，形态学鉴定往往具有局限性。近些年来，随着现代分子生物学技术的不断发展，将ＰＣＲ扩增和序列分析技术相结合，可以从基因水平揭示物种间的差异和系统发生关系［１］。在开展寄生虫的分子鉴定和分子分类学研究中，选择适当的遗传标记至关重要。ＩＴＳ是ｒＤＮＡ中介于１８Ｓ和２８Ｓ之间的内转录间隔区，包括ＩＴＳ１、５．８Ｓ rDNA和ＩＴＳ２，进化速度快且长度不大，加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是理想的种间鉴定的遗传标记，这对于寄生虫的分子分类学、分子遗传学、种（株）鉴定等方面的研究有重要意义［２，３］。

目前，尚未见到有关鸽蛔虫鉴定的报道。为此，本试验通过对鸽蛔虫样品的ＤＮＡ提取，ＩＴＳ rDNA克隆及序列分析，旨在鉴定出鸽蛔虫的种类，为进一步的分子遗传学和分子诊断学研究以及鸽蛔虫病的防治打下基础。

１材料与方法

１．１材料

鸽蛔虫采自广东省佛山市某鸽场，置于体积分数为７０％的乙醇中保存，ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＥｃｏＲⅠ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶和ｐＭＤ１８－Ｔ载体均购自宝生物工程（大连）有限公司，蛋白酶Ｋ购自德国默克医药公司，ＵＮＩＱ－１０柱式ＰＣＲ产物纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，ＤＮＡ抽提试剂盒ＷｉｚａｒｄＴＭＤＮＡＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，大肠杆菌ＤＨ５α为华南农业大学兽医寄生虫学实验室保存。

１．２方法

１．２．１鸽蛔虫总ＤＮＡ的提取取单个鸽蛔虫成虫的一小段于１．５ｍＬ离心管中，剪碎并研磨，然后加入２７５ μＬ的ＳＤＳＤＮＡ裂解液，混匀后放入微量恒温器中，于５５ ℃作用１６～１８ｈ，每隔１～２ｈ振荡１次。消化完全后，根据ＷｉｚａｒｄＴＭＤＮＡＣｌｅａｎ－ＵｐＳｙｓｔｅｍ使用说明，对虫体悬液进行提取。

１．２．２引物的选择与合成参照文献［４－７］选择能扩增大部分线虫ＩＴＳ rDNA基因的ＢＤ１和ＢＤ２分别作为上游和下游引物，其中ＢＤ１序列为５′－ＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡ－３′，ＢＤ２序列为５′－ＡＴＧＣＴＴＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ－３′。上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预期扩增片段大小约１０００ｂｐ。

１．２．３ＩＴＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增向０．２ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中依次加入１０×Ｂｕｆｆｅｒ（不含Ｍｇ２＋）２．５ μＬ、８．０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ２．０ μＬ、２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２．０ μＬ、２５ｐｍｏｌ／μＬＢＤ１０．５ μＬ、２５ｐｍｏｌ／μＬＢＤ２０．５ μＬ，５Ｕ／μＬＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５ μＬ、模板ＤＮＡ２．０ μＬ，最后补去离子水使ＰＣＲ反应体系的总体积为２５ μＬ。ＰＣＲ反应条件：９４ ℃预变性５ｍｉｎ；９４ ℃、３０ｓ，５５ ℃、３０ｓ，７２ ℃、１ｍｉｎ，３７个循环；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１％的琼脂糖凝胶电泳分析。

１．２．４ＩＴＳｒＤＮＡ的克隆用ＵＮＩＱ－１０柱式ＰＣＲ产物纯化试剂盒回收目的片段，将其连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，将重组质粒转化感受态细胞ＤＨ５α，涂布于含氨苄青霉素的ＬＢ平板上，于３７ ℃培养过夜，挑取阳性菌落进行菌液ＰＣＲ初步鉴定。将阳性菌液送上海博尚生物技术有限公司进行核苷酸序列测定。

１．２．５序列分析将所测定的序列与ＧｅｎＢａｎｋ中所收录的相关序列进行比对。使用ＤＮＡｓｔａｒＶ５．０７的ＥｄｉｔＳｅｑ和Ｍｅｇａｌｉｇｎ程序进行序列分析，比较其核苷酸序列相似性和遗传关系，并在此基础上建立系统进化分析图。

２结果

２．１鸽蛔虫ＩＴＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增结果

将ＰＣＲ产物于１％琼脂糖凝胶进行电泳，可见大小约１０００ｂｐ的条带（图１），与预期目的片段大小一致。用纯化回收试剂盒回收ＰＣＲ产物并将之克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化至感受态细胞ＤＨ５α，取鸽蛔虫样品１、２的白色单菌落进行菌液ＰＣＲ鉴定，均得到大小约１０００ｂｐ的条带。

２．２序列比对结果

选取鸽蛔虫样品１、２的阳性克隆样品送上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果表明这两份样品的ＩＴＳｒＤＮＡ序列大小均为１０４５ｂｐ。将获得的序列进行ＢＬＡＳＴ分析，结果表明，其５．８ＳｒＤＮＡ序列与鸡蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＪ００１５０８）的相似性分别为95.5％和94.3%，证明此ＩＴＳｒＤＮＡ序列为蛔虫的。然后利用ＤＮＡｓｔａｒ V５．０７对２个样品的ＩＴＳｒＤＮＡ序列进行比对，其同源性为９８．７％。

２．３系统进化分析结果

用ＤＮＡｓｔａｒ V５．０７将测序所得的鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）与ＧｅｎＢａｎｋ收录的其他蛔虫的相应序列进行比较分析，结果见图２和图３。

从图２和图３可知，从广东省佛山市分离的鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）序列和ＧｅｎＢａｎｋ中所收录的澳大利亚鸽蛔虫、猪蛔虫、牛新蛔虫、人蛔虫、澳大利亚鸡蛔虫、简单异尖线虫、犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和狮弓蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列存在着不同程度的差异。其中，从广东省佛山市分离的鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＡＣ００１、ＡＣ００２）与澳大利亚鸽蛔虫５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＪ００１５０９）处于并列位置，相似性分别为９６．８％和９５．５％，而与澳大利亚鸡蛔虫５．８ＳｒＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＡＪ００１５０８）相似性分别为９５．５％和９４．３％，因此可以说ＡＣ００１、ＡＣ００２与ＡＪ００１５０９同源性较高，所以可以推断鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列非常保守，但还是存在着国家或地区上的地理差异。

３讨论

随着生物种群的不断进化和发展，寄生虫的形态学鉴定越来越显出它的局限性，尤其对那些相似种或近缘种来说，从形态上很难进行区分，这时就需要采用其他方法来对寄生虫进行分类和鉴定。随着分子生物学技术的发展，采用ＰＣＲ方法对寄生虫某段具有种特异性的ＤＮＡ进行序列分析成为寄生虫分类和鉴定的必要手段。ＩＴＳ是ｒＤＮＡ中介于１８Ｓ和２８Ｓ之间的内转录间隔区，包括ＩＴＳ１和ＩＴＳ２两段序列，在种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异。而在生物进化过程中１８Ｓ、５．８Ｓ和２８ＳｒＤＮＡ具有种内高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是理想的种间鉴定的遗传标记［８－１１］。以ＩＴＳ为遗传标记进行ＰＣＲ扩增与序列比较已经成功地应用于多种寄生虫的分子水平的鉴定及分类。

因此试验也采用ＰＣＲ扩增鸽蛔虫ＩＴＳｒＤＮＡ并进行序列分析，从而对鸽蛔虫的分子鉴定和分子分类进行研究。由于ＮＣＢＩ数据库对于鸽蛔虫的ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列暂时还没有报道，因此本试验未对ＩＴＳ１和ＩＴＳ２序列做进化分析。而将鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ（ＡＣ００１、ＡＣ００２）序列与ＡＪ００１５０９序列进行了比较，结果表明，澳大利亚鸽体内的鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ序列和广东省佛山市鸽体内鸽蛔虫的５．８ＳｒＤＮＡ有较高的同源性（分别为９６．８％和９５．５％），但还是存在着国家或地区上的地理差异。该研究为鸽蛔虫分类、鉴定和遗传变异的进一步研究打下了基础。

参考文献：

［１］ＣＨＩＬＴＯＮＮＢ，ＧＡＳＳＥＲＲＢ，ＢＥＶＥＲＩＤＧＥＩ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆＡｕｓｔｒａｌｉａｎｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｎｅｍａｔｏｄｅｓｉｎｆｅｒｒｅｄｆｒｏｍｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９７，２７（１２）：１４８１－１４９４．

［２］ＧＡＳＳＥＲＲＢ，ＭＯＮＴＩＪＲ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｂｙＰＣＲＳＳＣＰｏｆＩＴＳ２ｒＤＮＡ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，１９９７，１１（３）：２０１－２０９．

［３］ＬＩＧＱ，ＨＵＹＬ，ＫＡＮＵＳ，ｅｔａｌ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅＩＴＳ１ｒＤＮＡｏｆＣｕｌｉｃｏｉｄｅｓａｒａｋａｗａｅ［Ｊ］．ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２００３，１１２（１）：１０１－１０８．

［４］蔺东，刘群，蒋金书，等．ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法在蛔虫种间鉴别上的应用［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００２，３３（６）：５８５－５９０．

［５］林瑞庆，蔡天城，吴桂英，等．鸡蛔虫ＩＴＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增克隆及序列分析［Ｊ］．中国兽医杂志，２００８，４４（３）：２４－２５．

［６］ＪＯＵＳＳＯＮＯ，ＢＡＲＴＯＬＩＰ．ＵｓｅｏｆｔｈｅＩＴＳｒＤＮＡｆｏｒｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎｏｆｓｏｍｅｌｉｆｅ－ｃｙｃｌｅｓｏｆＭｅｓｏｍｅｔｒｉｄａｅ（Ｔｒｅｍａｔｏｄａ，Ｄｉｇｅｎｅａ）［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９８，２８（９）：１４０３－１４１１．

［７］ＧＡＳＳＥＲＲＢ，ＲＯＣＡＬ，ＺＨＵＸＱ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｅｍａｔｏｄｉｒｕｓｓｐｅｃｉｅｓ（Ｎｅｍａｔｏｄａ：Ｍｏｌｉｎｅｉｄａｅ）ｆｒｏｍｗｉｌｄｒｕｍｉｎａｎｔｓｉｎＩｔａｌｙｕｓｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｍａｒｋｅｒｓ１［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９９，２９（１１）：１８０９－１８１７．

［８］牛庆丽，罗建勋，殷宏．转录间隔区（ＩＴＳ）在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展［Ｊ］．中国兽医寄生虫病，２００８，１６（４）：４１－４７．

［９］吕召宏，徐广庭，林瑞庆．鸡异刺线虫ＩＴＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００５，３２（８）：４１－４４．

［１０］ＴＲＯＥＬＬＫ，ＭＡＴＴＳＳＯＮＪＧ，ＡＬＤＥＲＢＯＲＮＡ，ｅｔａｌ．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＴＭ）ａｎａｌｙｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｄｉｓｃｒｅｔｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＨａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓｆｒｏｍｓｍａｌｌｒｕｍｉｎａｎｔｓ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，２００３，３３（７）：７６５－７７１．

［１１］ＨＵＮＧＧＣ，ＣＨＩＬＴＯＮＮＢ，ＢＥＶＥＲＩＤＤＧＥＩ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｃｒｙｐｔｉｃｓｐｅｃｉｅｓｗｉｔｈｉｎＣｙｌｉｃｏｓｔｅｐｈａｎｕｓｍｕｎｕｔｕｓ（Ｎｅｍａｔｏｄａ：Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９９，２９（２）：２８５－２９１．

（责任编辑田宇曦）

收稿日期：２０１１－１１－２１

基金项目：广东省自然科学基金项目（１０１５２８００００１０００００７）

作者简介：李金平（１９８４－），女，广东茂名人，硕士，研究方向为预防兽医学，（电话）１５８８９９６７０１４（电子信箱）ｌｉｊｉｎｐｉｎｇ２００７＠１２６．ｃｏｍ；

通讯作者，张浩吉，教授，（电话）１３９２９９６４８６９（电子信箱）ｚｈａｎｇｈａｏｊｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。