SSR法鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨Ⅲ。两个形态学差异较大的品种间掺杂回收试验

廖芳丽 林梅 张宇飞 赵虹 熊先锋 张凯 涂书新

摘要：在两系杂交稻两优培九的大群体田间纯度鉴定中，定向掺入形态学差异较大的两系杂交稻新两优６３８０，逐株抽取田间植株叶片样品，运用ＳＳＲ法进行鉴定。结果表明，运用ＳＳＲ法能够准确地检测出掺入的新两优６３８０。在室内检测的谱带中发现，新两优６３８０的带型与两优培九不育系带型的位置相同。

关键词：两系杂交稻；大群体；掺杂回收；带型比对

中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７８９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－3941-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ－Lｉｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ） Ⅲ．Ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｗｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ

ＬＩＡＯ Ｆａｎｇ－ｌｉ１，ＬＩＮ Ｍｅｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ－ｆｅｉ１，ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ１，ＸＩＯＮＧ Ｘｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ２，ＴＵ Ｓｈｕ－ｘｉｎ３

（１． Ｓｅｅｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｎgｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｊｉｎgｚｈｏｕ ４３４０２０， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ２．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎgｚｈｏｕ ４３４０２５， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｒｏｕｐｓ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ ｖａｒｉｅｔｙ Ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ａｎｏｔｈｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＳＳＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｄｕｌｔｅｒａｔｅｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘａｃｔｌｙ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌａｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｉｎｌｉａｎｇｙｏｕ ６３８０ ａｎｄ Ｌｉａｎｇｙｏｕｐｅｉ ９ ｓｔｅｒｉｌｅ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｗｏ－ｌｉｎｅ ｈｙｂｒｉｄ ｒｉｃｅ； ａ ｌａｒｇｅ ｇｒｏｕｐ； ａｄｕｌｔｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ； ｌａｎｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ

由于ＤＮＡ提取方法的简化、琼脂糖凝胶电泳技术的运用，以及ＳＳＲ分子标记鉴定两系杂交水稻种子纯度具有快速、重复性好、多态性高等优点，使得ＳＳＲ法成为目前室内鉴定两系杂交水稻种子纯度时应用最为广泛的分子标记方法［１－６］。但是琼脂糖凝胶电泳成像的谱带分辨率低，信息量不充分，谱带的主带一般表现为不育系、恢复系和杂交种３种类型，不能区分不同的杂株类型。

为验证该方法的可靠性和准确性，前人的研究一般是在鉴定时，采取人为在鉴定样品中掺入该组合的恢复系、保持系、不育系的方法来检验［７－９］。但在田间正季种植鉴定条件下，用两系杂交水稻种子大群体定位掺杂回收，且对掺入的杂交种子杂株谱带特征的研究目前鲜有报道［１０－１３］。

此次研究的目的在于了解单对引物对亲缘关系较远的品种的识别率，验证单对引物ＳＳＲ法测定亲缘较远的两系杂交水稻种子纯度的准确性和可靠性，同时探讨样品中混入其他杂交种的谱带特征。

１材料与方法

１．１材料

试验材料是在通过系谱比较后，选用遗传背景不同、亲缘关系较远的两优培九（培矮６４Ｓ×９３１１）和新两优６３８０（０３Ｓ×Ｄ２０８）两个品种。这两个品种由荆州市种子管理局从市场上抽取商品种子，并经生产企业确认。所用引物及试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。

１．２ＰＣＲ反应体系

ＰＣＲ扩增反应总体积１０μＬ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．２μＬ，５０ｎｇ／μＬ ｐｒｉｍｅｒ ０．２μＬ ＋０．２μＬ，２Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶０．６μＬ，２５ｎｇ／μＬ ＤＮＡ １μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６．８μＬ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性４ｍｉｎ；然后进行３５个循环的扩增，循环参数为９４℃、１５ｓ，５５℃、１５ｓ，７２℃、３０ｓ；最后在７２℃下延伸７ｍｉｎ。扩增产物在含ＥＢ的３％琼脂糖凝胶中进行电泳后，应用凝胶成像系统观察记录。

１．３掺杂和抽样方法

试验于２０１１年４月１５日播种，５月１５日移栽。小区单本栽植５００株苗，５０行，每行１０株，行距２６．７ｃｍ，株距１６．７ｃｍ。每个植株用４位数编号，前两位数表示所在的行数，后两位数表示所在行的位置，例如０５０８表示第５行的第８株。在两优培九田间鉴定移栽时，每隔9株混栽１株新两优６３８０。两个品种之间的植株特征特性差别较大，易于田间识别（表１）；同时两个品种之间的遗传背景差异较大，易于室内检出。

返青后按对应编号采取田间各植株的倒二叶叶片，用ＲＭ１１对两优培九进行室内分子检测，为了防止人为因素干扰，试验过程中将掺杂、田间鉴定和室内ＳＳＲ检测的操作分别由３批不同的专业人员独立完成。

１．４结果比对

在抽穗前及齐穗后分两次按ＧＢ／Ｔ ３５４３．５－１９９５进行田间纯度鉴定，并将田间结果与室内ＳＳＲ法的纯度检出结果进行比对，验证室内与田间结果的一致性。

２结果与分析

２．１混入的杂株田间和室内鉴定结果

室内ＳＳＲ法将小区的所有植株都抽样检测，共检出杂株６８株，其中掺入的新两优６３８０共５０株，样品自有杂株１８株，掺入株的检出率为１００％。掺入的新两优６３８０谱带特征如图１所示。

从表２中可见，两优培九田间鉴定中，共发现杂株６２株，其中掺入的新两优６３８０共５０株，样品自有杂株１２株，掺入株的检出率为１００％。

２．２杂株谱带与两优培九及其亲本的谱带比较

引物筛选时，两优培九的不育系带型在杂交种互补带型的下方，恢复系带型在杂交种互补带型的上方。掺入的新两优６３８０的带型均在互补带型的下方，与两优培九不育系的谱带位置相同。

３小结与讨论

研究表明，应用ＳＳＲ法对两系种子纯度进行鉴定时，虽能准确地把掺入的亲缘关系较远的其他两系杂交稻品种识别出来，但不能仅根据室内ＳＳＲ法电泳得到的杂株谱带类型简单地推断其田间形态为不育系或恢复系类型杂株，必须进行田间比对才能作出准确判断。

结合文献［１４］的结论可以看出，对特定品种及适宜的引物而言，如果田间杂株为真实的不育系或恢复系，ＳＳＲ法的谱带一定为不育系或恢复系的特征谱带，反之，如果谱带表现为不育系或恢复系的特征谱带，植株田间表现型并不一定是不育系或恢复系。

对与亲缘关系较近的品种，因为亲本间遗传差异较小，而ＳＳＲ法标记的是一些无意义的ＤＮＡ重复序列，这些ＤＮＡ片段很可能都会在亲缘关系较近的品种中普遍存在，从而使亲缘关系较近但田间表现型差异明显的品种显示出相同的带谱，从而产生种子纯度误判风险，这方面还需进一步研究。

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［４］ 谭智丹，余显权，高健强，等．利用ＳＳＲ鉴定杂交水稻种子纯度的研究［Ｊ］．种子，２００６，２５（４）：２７－３３

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［１２］ 张辉，姜勇．杂交水稻品种鉴定和纯度分析技术研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２００９，３７（２０）：９４１６－９４１９．

［１３］ 殷兆晴，王玉平，周黎军，等．杂交稻种子纯度的ＳＳＲ分子检测及应用研究［Ｊ］．西南农业学报，２００６，１９（６）：１０００－１００４．

［１４］ 张凯，赵虹，张宇飞，等． ＳＳＲ法鉴定水稻两系杂交种纯度的运用与探讨Ⅰ．亲本和杂交种分别筛选引物的适应性［Ｊ］．湖北农业科学，２０１２，５１（１０）：１９６５－１９６６，１９７０．

（责任编辑郑威）

收稿日期：２０１２－０４－１１

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３００７）

作者简介：廖芳丽（１９７８－），女，湖北天门人，助理农艺师，主要从事农作物种子质量检验及管理工作，（电话）０７１６－８４４３２５２（电子信箱）

ｊｙｊｙｋ５０２＠１６３．ｃｏｍ；通讯作者，张凯（１９８３－），男，在读硕士研究生，研究方向为农作物育种，（电话）０７１６－８４００６４３（电子信箱）

ｆｏｎｇｙｕｎ００＠ｔｏｍ．ｃｏｍ。