万寿菊花中叶黄素提取工艺的优化

李凤伟 刘丽娜

摘要：为了研究采用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取万寿菊（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ Ｌ．）花中叶黄素的最佳工艺条件，采用五因素五水平正交试验提取叶黄素，用高效液相色谱法测定皂化后的叶黄素产量。用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取叶黄素的最佳试验参数为提取温度８０ ℃、料液比１∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、静态萃取时间１０ ｍｉｎ、静态周期数３、冲洗体积７０％。

关键词：万寿菊（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ Ｌ．）花；叶黄素；提取；正交试验

中图分类号：Ｑ９４９．７８３．５；ＴＳ２０２．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）18－4094-03

Optimization of Extraction Technology of Lutein from Marigold Flower

ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｌｉ－ｎａ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｌｕｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｇｏｌｄ ｆｌｏｗｅｒ ｂｙ ＡＳＥ－１００ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ， ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ－ｆｉｖｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｙｅｉｌｄ ｏｆ ｌｕｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｆｔｅｒ ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｌｕｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｍａｒｉｇｏｌｄ ｆｌｏｗｅｒ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ８０ ℃； ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶３０（ｍ／Ｖ， ｇ∶ｍＬ）； ｓｔａｔｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， １０ ｍｉｎ； ｓｔａｔｉｃ ｃｙｃｌｅ， ３； ｆｌｕｓｈ ｖｏｌｕｍｅ， ７０％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｒｉｇｏｌｄ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ Ｌ．）flower； ｅｘｔｒａｃｔ； ｌｕｔｅｉｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

万寿菊（Ｔａｇｅｔｅｓ ｅｒｅｃｔａ Ｌ．）为菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）万寿菊属（Ｔａｔｅｇｅｓ）的植物，亦称金盏菊、臭芙蓉、万盏灯、蜂窝菊等［１］。万寿菊花中叶黄素含量非常高，其他类胡萝卜色素的含量非常低，是提取叶黄素的理想材料。目前对万寿菊的研究多集中在万寿菊花的叶黄素。叶黄素是一种天然的类胡萝卜素，广泛地分布在水果和蔬菜中，特别是在万寿菊花中。早在２０世纪８０年代中期，西方医学研究人员就发现植物所含天然叶黄素是一种性能优异的抗氧化剂［２］。将一定量的叶黄素添加到食品中，可防止人体因器官衰老引起一系列疾病的发生。大量流行病学证据表明，叶黄素对视觉有保护作用，并且具有预防白内障［３］和动脉硬化的作用，具有增强免疫力等功效［４］，特别在预防癌变发生、延缓癌症发展等方面起着重要作用［５］，是目前国际上功能性食品成分研究中的一个热点。

目前一般用有机溶剂法提取万寿菊中叶黄素，操作较复杂。ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪是一台可从各种固体或半固体样品中萃取有机组分的自动系统，通过提高溶剂温度的方法加速传统的萃取处理，在萃取过程中向萃取池中加压以使萃取池中填充的溶剂始终处于液态。加热后，提取物从样品池中冲到标准的收集瓶中以备分析使用。通常ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取一个样品需要１５～２５ ｍｉｎ，提高了工作效率，减少了工作量，工艺流程简单，操作方便，提取完全。试验对用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取的万寿菊花中叶黄素进行研究，以期为使用该仪器提取叶黄素提供参考。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料与试剂橙色万寿菊花是在２００６年８月末采于吉林省敦化市，经吉林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定为菊科植物万寿菊花；叶黄素标准品购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司；正己烷、丙酮、Ｈ３ＰＯ４晶体、Ｎａ２ＣＯ３、ＫＯＨ、ＨＡｃ均为分析纯；甲醇为色谱纯；水为杭州娃哈哈纯净水。

１．１．２仪器与设备ＥＹＥＬＡ旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司，ＧＢ２０４电子分析天平购自德国赛多利斯集团，ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪购自戴安中国有限公司，ＴＵ１８００紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司，Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪购自美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司。

１．２方法

１．２．１叶黄素产量测定的色谱条件色谱柱为Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０．０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为体积比为９３．５∶６．５的甲醇、水混合液，流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，波长为４４４ ｎｍ，柱温为２５ ℃。

１．２．２标准曲线的绘制精确称取２０．０５ ｍｇ叶黄素标准品置于２５ ｍＬ容量瓶中，用丙酮溶解、定容。精确量取０．１、０．５、１．０、３．０、５．０、７．０ ｍＬ溶液分别置于１０ ｍＬ容量瓶中，用丙酮定容，塞上塞子，旋转振摇１ ｍｉｎ，分别吸取上述标准品溶液各２０ μＬ，用高效液相色谱法进行测定。以峰面积ｙ为纵坐标，标准品溶液浓度ｘ为横坐标绘制标准曲线，回归方程为

■＝９９ ５０２．０００ｘ＋９５．８５９，相关系数ｒ＝０．９９９ ４。

１．２．３正交设计方案影响提取的因素有提取温度、料液比、静态萃取时间、静态周期数和冲洗体积。为了找出最佳的提取条件组合，设计了Ｌ２５（５６）正交方案，因素与水平见表１。

１．２．４叶黄素的提取方法取万寿菊花的花瓣置于４０ ℃烘箱中４８ ｈ，然后粉碎，过６０目筛，取６０目花瓣粉末干燥备用。叶黄素是一类具有聚异戊二烯结构的脂溶性色素，常用有机溶剂进行提取，本试验采用正己烷进行提取。称取一定量干燥的万寿菊花粉末，置于萃取池中，用正己烷溶剂在不同提取温度、料液比、静态萃取时间、静态周期数、冲洗体积（用占萃取池体积的百分比表示）下进行五因素五水平正交试验提取叶黄素，３次重复，结果取平均值。提取结束后将提取液用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，得到叶黄素油脂，避光于低温保存，备用。

１．２．５叶黄素的皂化由于叶黄素在万寿菊中是以与月桂酸、肉豆蔻酸、油酸以及亚麻酸酯化的形式存在的，经过了有机溶剂的萃取后，它们的存在形式并没有发生变化，因而进一步纯化前必须要经过皂化处理，将叶黄素还原为单体形式。

１）前处理。将得到的叶黄素油脂浓缩到一定体积后加到三角瓶中，搅拌，水浴温度控制为４０ ℃。加入适量的２５ ｇ／Ｌ Ｎａ２ＣＯ３溶液，混合振荡５ ｍｉｎ，弃除水相，３次重复。将得到的油脂再转入另一个三角瓶中，加入适量的１０ ｇ／Ｌ Ｈ３ＰＯ４，混合振荡５ ｍｉｎ，弃除水相，３次重复。最终得到精制的油脂。

２）皂化。将油脂加入到三角瓶中，匀速搅拌，慢慢加入适量的４００ ｇ／Ｌ ＫＯＨ溶液，温度控制为６０ ℃，反应８ ｈ，反应完毕后薄层扫描，结果显示油脂的皂化率约为８０％［６］。薄层色谱法是一种简单常用的测量皂化程度的方法，采用普通硅胶板［７］，展开剂为体积比７∶３的正己烷、丙酮混合液。

３）ｐＨ的调节。皂化完毕后转入三角瓶中，加入适量的水，水浴温度控制为５０ ℃，滴加２５０ ｇ／Ｌ ＨＡｃ，充分振荡，调节至ｐＨ ５，继续搅拌３０ ｍｉｎ，转入分液漏斗中，弃除水相，再用去离子水洗至中性。真空干燥得到油相。

１．２．６叶黄素产量的测定将皂化后的叶黄素用丙酮溶解并定容到５００ ｍＬ容量瓶中，摇匀后按１．２．１的方法测定。叶黄素产量（Ｙ）的计算：Ｙ（ｍｇ）＝Ｗ×５００，Ｗ为测得样品液峰面积对应的叶黄素浓度（ｍｇ／ｍＬ），５００为溶液体积的数值（ｍＬ）。

２结果与分析

在正交试验中，每个萃取过程３次重复，３次重复值的离差小于５％，取３次结果的平均值为正交试验的结果进行方差分析，正交试验结果见表２，方差分析结果见表３。

由表２可知，各因素对叶黄素提取结果的影响为料液比＞静态萃取时间＞静态周期数＞提取温度＞冲洗体积。采用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取叶黄素的最佳工艺条件为Ａ５Ｂ５Ｃ２Ｄ３Ｅ４，即提取温度８０ ℃、料液比１∶３０、静态萃取时间１０ ｍｉｎ、静态周期数３、冲洗体积７０％。最优条件下的叶黄素产量为１４７．７５ ｍｇ，大于正交试验结果。由表３可知，提取温度、料液比、静态萃取时间、静态周期数和冲洗体积对叶黄素提取的影响都不显著。

ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪是采用高压进行提取的，所以试验均采用６０目原料进行提取。万寿菊油脂应避免用８０ ℃以上高温长时间加热，所以在正交试验中选择提取温度为８０ ℃以下进行筛选。试验结果表明，最佳提取温度为８０ ℃，说明提取温度高时叶黄素产量较高；１０ ｍｉｎ为最佳静态萃取时间，说明１０ ｍｉｎ的静态萃取就已经很完全，继续增加静态萃取时间对叶黄素的提取影响很小，这更说明了ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪具有提取速度快的特点；静态周期数３为最佳提取次数，说明３次提取就已经很完全，继续增加提取次数对叶黄素的提取影响很小。由图１和图２可知，在此高效液相色谱条件下测定样品中叶黄素的产量时，方法快速、准确，分离度好。

３结论

采用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取万寿菊中叶黄素的最佳工艺条件为提取温度８０ ℃、料液比１∶３０、静态萃取时间１０ ｍｉｎ、静态周期数３、冲洗体积７０％。万寿菊花中叶黄素产量较高，用ＡＳＥ－１００加速溶剂萃取仪提取叶黄素的方法操作简便、提取效率高，适合于工业化生产。

参考文献：

［１］ 王新国，徐汉虹，赵善欢．杀虫植物万寿菊的研究进展［Ｊ］． 西安联合大学学报，２００２，５（２）：５－１０．

［２］ ＹＥＵＭ Ｋ Ｊ，ＡＬＤＩＮＩ Ｇ，ＣＨＵＮＧ Ｈ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｔａｃｋｉｎｇ ｒａｄｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２００３，１３３（８）：２６８８－２６９１．

［３］ 尤新． 叶黄素（ｌｕｔｅｉｎ）及其护眼功能［Ｊ］． 中国食品添加剂，２００３，１４（５）：１－３．

［４］ ＬＡＮＤＲＵＭ Ｊ Ｔ，ＢＯＮＥ Ｒ Ａ． Ｌｕｔｅｉｎ，ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｃｕｌａｒ ｐｉｇｍｅｎｔ［Ｊ］． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２００１，３８５（１）：２８－４０．

［５］ 孙震，姚惠源． 叶黄素的抗癌作用及其研究现状［Ｊ］．生物技术通讯，２００５，１６（１）：８４－８６．

［６］ 王振，韩鲁佳，王唯涌． 万寿菊中叶黄素的提取皂化工艺［Ｊ］． 中国农业大学学报，２００６，１１（２）：３１－３４．

［７］ 陈利梅，戴桂芝，孙小凡． 万寿菊黄色素稳定性的研究［Ｊ］．食品与药品，２００５，７（６）：３６－３９．

收稿日期：２０１１－１１－０９

作者简介：李凤伟（１９８０－），女，辽宁北票人，讲师，硕士，主要从事天然产物方向的研究，（电话）１３８１５５７６６１７（电子信箱）ｌｉｆｅｎｇｗｅｉ１９８０＠１２６．ｃｏｍ。