大黄乙醇提取物的鸡体内抗新城疫病毒试验

王华,程太平

摘要：以雏鸡作为试验鸡，在NDV IV系病毒感染的不同时间段（感染前5～6 h、感染后5～6 h、感染后18～20 h），以3个不同剂量的大黄乙醇提取物经皮下注射和口服给药，进行体内抗病毒试验，以脾脏中NDV IV系病毒相对含量作为抗病毒作用效果。试验结果表明，在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h，以3个不同剂量的大黄乙醇提取物处理，脾脏中NDVIV系病毒相对含量都明显下降；而在NDVIV系病毒感染后18～20 h，以3个不同剂量的大黄乙醇提取物处理，脾脏中NDVIV系病毒相对含量下降不明显。在NDVIV系病毒感染的适宜时间，以适宜剂量大黄乙醇提取物进行防治具有一定疗效；大黄乙醇提取物在试验鸡体内抵抗NDVIV系病毒感染与给药剂量及给药时机有密切关系；大黄乙醇提取物5.0 mL·kg-1·次-1大剂量组对试验鸡是安全的。

关键词：大黄乙醇提取物；三黄鸡；NDVIV系病毒

中图分类号：S792.99文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.008

Anti-viral Effect of Rhubarb Ethanol Extract on Newcastle Disease Virus to Chickens in Vivo

WANG Hua，CHENG Tai-ping

（College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou ，Hubei 434025, China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Antiviral experiment in vivo was did in chicks with rhubarb ethanol extracts of three different dose by subcutaneous injection and oral administration in different time periods of the NDV IV strain virus infection(5~6 h before infection,5～6 h post infection,18～20 h post infection), and antiviral effect was evaluated by relative amounts of NDV IV strain virus in the spleen. The test results showed that relative contents of NDV IV strain virus in spleen decreased obviously, the chick were treated with three different doses of rhubarb ethanol extract in 5～6 h before infection and 5～6 h post infection with the NDV IV strain virus; while in 18～20 h post infection by NDV IV strain virus, the chick were treated with three different doses of rhubarb ethanol extract, relative contents of NDV IV strain virus in spleen did not decreased obviously. The experimental results showed that the prevention had definite curative effect in infection suitable time of the NDV IV strain virus with suitable dose of rhubarb ethanol extract, and the curative effect against infection of NDV IV strain virus was connected closely with drug dosage and dosing time with rhubarb ethanol extract in experimental chickens, and rhubarb ethanol extract (5.0 mL·kg-1 body weight, large dose group) was safe to experimental chicken.

Key words: rhubarb ethanol extracts; three yellow chicken; NDV IV strain virus

大黄的某些成分具有一定的抗病毒作用，一些试验结果表明，大黄乙醇提取物对风疹病毒[1-2]、疱疹病毒[3-4]、新城疫病毒[5]、乙型肝炎病毒[6]等具有一定抗病毒作用。王志玉等[5]采用体外细胞培养方法研究大黄乙醇提取物对新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）感染的拮抗作用，0.5 g·L-1大黄乙醇提取物对NDV所致的CPE有明显抑制作用。在畜禽病毒性疾病防治方面，特别是以畜禽个体为试验对象，在畜禽体内给药来做抗病毒试验，还未有报道，但这对于某些动物病毒性疾病的防治具有更重要意义。本研究以三黄鸡作为试验对象，以大黄乙醇提取物为试验药物，以NDV IV系弱毒株为感染病毒，来探讨大黄乙醇提取物在鸡的体内是否对NDV具有明显的抗感染作用，为以后大黄乙醇提取物的抗病毒防治研究奠定基础。

1材料和方法

1.1大黄乙醇提取物的制备

从药店购买药用大黄，按1 kg生大黄加2 L乙醇溶液（100 mL内含有95 mL乙醇），浸泡12～16 h，85～90 ℃加热2 h，过滤，收集滤液。将滤渣再加乙醇溶液，加入量为第一次的80%，85～90℃加热2 h，过滤，收集滤液，合并两次的滤液，减压浓缩，然后自然干燥或50 ℃烘箱干燥。以灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）（0.05 mol·L-1、pH值7.2）稀释大黄乙醇提取的干燥物，浓度为0.25 g·mL-1。

1.2NDV IV系弱毒的准备

NDV IV系（La Sota）弱毒疫苗，武汉中博生物有限公司生产，批号2011092，500羽份·瓶-1，-20 ℃保存，临用时加入灭菌过的等渗PBS（0.1 mol·L-1、pH值7.4）12 500 μL进行稀释，以滴鼻方式对每只试验鸡进行接种，接种量为50 μL。

1.3试验鸡的准备和接种NDV IV系弱毒

从市场上购买三黄肉鸡雏鸡苗300只，2日龄，用15个大纸箱分开，按肉鸡饲养规范进行饲养。饲养到21日龄时，挑出弱鸡苗及达不到体重标准的鸡苗，将剩下的鸡苗混合，挑出252只，随机分成21个组，每组12只，第4组、第11组和第18组为对照组，其余各组为给药组。在22日龄的中午（13时─14时），以滴鼻方式，用微量加样枪对第1组到第21组的每只试验鸡接种NDV IV系弱毒病毒，接种量为50 μL。在饲养过程中，要做好卫生及隔离，防止病原体的感染。

1.4试验鸡的给药

试验鸡接种NDV IV系病毒前5～6 h，对第1组、第2组和第3组的试验鸡，以皮下注射方式给药，剂量分别为1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第4组的试验鸡，皮下注射灭菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药8次。试验鸡接种NDV IV系病毒前5～6 h，对第5组、第6组、第7组的试验鸡，以口服方式给药，剂量分别为1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药8次。

试验鸡接种NDV IV系病毒后5～6 h，对第8组、第9组和第10组的试验鸡，以皮下注射方式给药，剂量分别为1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第11组的试验鸡，皮下注射灭菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药7次。试验鸡接种NDV IV系病毒后5～6 h，对第12组、第13组、第14组的试验鸡，以口服方式给药，剂量分别为1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药7次。

试验鸡接种NDV IV系病毒后18～20 h，对第15组、第16组和第17组的试验鸡，以皮下注射方式给药，剂量分别为1.0，2.5，5.0 mL·kg-1·次-1；第18组的试验鸡，分别皮下注射灭菌的PBS 5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药6次。试验鸡接种NDV IV系病毒后18～20 h，对第19组、第20组、第21组的试验鸡，以口服方式给药，剂量分别为1.0 ，2.5 ，5.0 mL·kg-1·次-1；以后每日2次，间隔10～12 h；连续给药6次。

1.5 试验鸡含毒组织的采集与NDV的检测

在NDV IV系病毒感染和治疗后第4天下午，在每个组中随机抽取5只鸡，将鸡致死后，采集每只鸡的脾脏，在2～8 ℃保存。剪取或切取适量的（一般不超过5 g）器官和组织，称质量，研磨，冻融3次，加等质量的灭菌过的等渗PBS（0.1 mol·L-1、pH值7.4，另加有5 000 IU·mL-1青霉素及5 mg·mL-1卡那霉素），充分混匀，倒入10 mL塑料离心管，低速离心，取上清液，编号，2～8 ℃保存，供检测NDV。

以微量法病毒血凝试验检测每份样品，采用V形底孔微量反应板。微量法病毒血凝试验的操作参考文献[7]，在V形底孔微量反应板上，一排孔只检测一个样品。不同之处是在第1孔中直接加一个样品处理液25 μL。

2 结果与分析

2.1各组试验鸡给药后的表现

各给药组及对照组的试验鸡，在给药或注射PBS后，至宰杀之前没有一只出现异常表现；宰杀之后，观察鸡的内脏器官和组织，也没有见到肉眼可见的病理变化。试验结果表明，所使用的药物是安全的，试验药物的剂量也没有超过安全范围。

2.2各组试验鸡的脾脏NDV检测结果

以病毒血凝试验检测各组试验鸡的脾脏的病毒血凝效价，即样品的原采样组织的稀释倍数以2X表示。某样品的NDV血凝效价低于2，即X值小于1，就记为“-”。各表中的数字为X的对应值，见表1至表3。各样品的病毒血凝效价以logY进行转换后计算几何平均数，Y等于2X。如果某样品的NDV血凝效价低于2，即X值小于1，在计算几何平均数时，该样品的logY值记作0。

表1中，第3组和第7组的样品检测结果均为阴性；第2组和第6组的样品检测结果只有一个为1；第1组的样品有3个为1，2个为阴性；第5组的样品均为1，但比对照组的样品低2个滴度。表1的结果显示，在NDV IV系病毒感染前5～6 h，皮下注射及口服给予大黄乙醇提取物，3个剂量组对NDV IV系病毒的感染和增殖都具有明显的抑制效果；3个剂量组，随着剂量的增加，抑制效果也增强，5.0 mL·kg-1·次-1剂量组抑制效果最好，2.5 mL·kg-1·次-1剂量组抑制效果次之。皮下注射与口服给予比较，对NDV IV系病毒的感染和增殖的抑制效果几乎没有差异。

表2中，第10组和第14组的样品检测结果均为阴性；第8组和第12组的样品均为1，但比对照组的样品低2个滴度。表2的结果显示，在NDV IV系病毒感染后5～6 h，皮下注射及口服给予大黄乙醇提取物，3个剂量组对NDV IV系病毒的感染和增殖都具有明显的抑制效果；随着剂量的增加，抑制效果也增强，5.0 mL·kg-1·次-1剂量组抑制效果最好，2.5 mL·kg-1·次-1剂量组抑制效果次之。皮下注射与口服给予，对NDV IV系病毒的感染和增殖的抑制效果几乎没有差异。

在表3中，第15组、第16组、第17组、第19组、第20组和第21组的几何平均数很接近，相差不到1个滴度，与对照组比较，大约相差1.5个滴度。表3的结果显示，在NDV IV系病毒感染后18～20 h，皮下注射及口服给予大黄乙醇提取物，3个剂量组对NDV IV系病毒的感染和增殖都具有一定的抑制效果，但抑制效果不明显，没有表1及表2的抑制效果好；3个剂量组的抑制效果几乎无差异。

3讨论

本试验以3个不同剂量的大黄乙醇提取物进行防治处理，经皮下注射和口服给药，试验结果表明，在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h给药处理，这3个剂量对NDV IV系病毒感染都具有明显抵抗作用。在NDV IV系病毒感染前5～6 h及感染后5～6 h给药处理，对NDV IV系病毒感染具有明显抵抗作用的更低剂量还有待进一步研究。

本试验选取NDV IV系病毒感染的3个时间段进行给药处理，前2个时间段的疗效与第3个时间段的疗效有这样大的差别，可能与药物作用机制和时效、NDV IV系病毒感染和增殖的机制有密切关系。大黄乙醇提取物抗NDV IV系病毒感染和增殖的机制还不明确。大黄抗单纯疱疹病毒的作用主要通过抑制该病毒的吸附和穿入过程而阻止病毒感染[3]。有研究显示，大黄可以阻断NDV侵入细胞和抑制病毒在感染细胞内复制；大黄乙醇提取物在体外具有直接杀伤NDV的作用[5]。大黄乙醇提取物中蒽醌类也具有直接杀伤疱疹病毒的作用[8]。

大黄乙醇提取物在NDV IV系病毒感染后多长时间不具有明显抗感染作用还需要作更多更详细的研究试验。不过，本试验结果暗示，在NDV IV系病毒感染的最早期，使用大黄乙醇提取物进行防治是有意义的。但对于NDV强毒毒株的感染，在感染的最早期，使用大黄乙醇提取物进行防治是否具有明显疗效，还不确定，由于NDV强毒的感染和增殖的机制与NDV IV系病毒（为弱毒株）感染和增殖的机制是有差异的。

参考文献：

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[3] 宋艳艳,王桂亭,王小凡.大黄乙醇提取物体内抗单纯疱疹病毒作用的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志,2003,17(2):169-173.

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[7] 白文彬,于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002:226.

[8] 王志玉,王桂亭,许洪芝,等.大黄醇提液的抗疱疹病毒作用[J].中国中药杂志,1996,21(6)364-366.