玉米丝轴黑粉菌原生质体制备与再生条件的研究

宁平　梁萍　向妮　郑用琏　肖炎农

摘要：以玉米丝轴黑粉菌（Sporisorium reilianum f.）为供试菌株，对其孢子原生质体的制备和再生条件进行研究。结果表明，交配型菌株SR1加入5 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzymes）、50 mg/mL崩溃酶（Driselase）与50 mg/mL蜗牛酶（Snailase）混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min摇床上酶解10 min，原生质体得率为99.36%、产量1.35×108个/mL，以山梨醇为稳渗剂，原生质体涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培养基上，再生率可达35.63%。

关键词：玉米丝轴黑粉菌；原生质体；制备；再生

中图分类号：S435.131.42文献标识码：A文章编号：0439-8114（2012）20-4520-04

玉米丝黑穗病是由玉米丝轴黑粉菌（Sporisorium reilianum f. ）引起的严重威胁玉米产量的病害。20世纪90年代前在中国发生较重，以后由于抗病品种的推广有所减轻。近年来，由于新品种的引进和抗性鉴定工作的滞后，玉米丝黑穗病又逐年加重，每年因玉米丝黑穗病危害减产达30万t[1]。玉米丝轴黑粉菌在玉米发芽期侵染，花期观察到明显症状，雌雄穗产生充满孢子堆的病瘿，表现为典型的苗期侵染、花期发病特点。一旦发病，往往整株都没有收成。虽然该病在苗期也有些症状，如植株矮小、茎基膨大如笋状、叶片簇生等，但是症状不明显，且不容易与其他病毒病、生理病害、根部虫伤等所致症状相区分，因此难以在苗期发现病情，给该病的早期防治带来一定难度。有学者研究苗期玉米丝黑穗病的检测技术，进行了质壁分离法PCR检测技术鉴定[2]以及利用苗期检测可溶性糖含量鉴定[3]等，这些方法有一定的局限性，难以应用于实际生产。人们选育较好的抗性品种用于玉米丝黑穗病防治，研究者在玉米抗玉米丝黑穗病育种方面的研究较多，如抗性机理、抗性遗传、抗病基因定位和抗病种质资源[4]等。从分子水平研究玉米丝轴黑粉菌的致病机制，有助于从根本上控制该病的危害。目前对玉米丝黑穗病菌的遗传转化国内外鲜有研究报道。试验通过制备该菌的原生质体，发展出有效的遗传转化体系，为研究玉米丝黑穗病菌的致病机制提供基础。

1.2试验方法

1.2.1原生质体的制备和影响因素测定玉米丝轴黑粉菌菌种接入PDA培养基中培养3 d，取1/20接种量转至新的PDA培养基继续培养24 h，离心收集菌体，无菌水洗涤1次，加入酶液（表1）后，置摇床上28 ℃ 100 r/ min酶解。每隔 5 min取样镜检观察，待视野中绝大多数孢子释放原生质体时停止酶解，2 000 r/ min离心 6 min后用STC缓冲液洗涤3次，离心收集原生质体。

1）不同酶及组合对原生质体制备的影响。以不同浓度的溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶单独处理或者混合处理玉米丝轴黑粉菌的担孢子，比较单一酶和混合酶对原生质体释放的影响。

2）不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响。用CPB配制不同浓度的NaCl、MgCl2、KCl、D-sorbitol、蔗糖5种渗透压稳定剂，比较不同渗透压稳定剂及不同浓度对原生质体制备的影响，确定最佳渗透压稳定剂[6]。

3）菌龄对原生质体制备的影响。将活化3 d后的玉米丝轴黑粉菌菌液以1/20的接种量扩大培养，收集不同时间段的担孢子以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶和50 mg/mL蜗牛酶3种酶混合酶解，比较菌龄对原生质体制备的影响。

4）酶解时间对原生质体制备的影响。在酶解5、10、15、20、25 min时观察原生质体的形成及数量。

5）酶解温度对原生质体制备的影响。比较25、28、30、35、37 ℃ 5个酶解温度对原生质体制备的影响。

1.2.2不同酶组合及酶解时间对原生质体再生的影响将不同酶浓度组合及不同酶解时间制备的原生质体用平板稀释法涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培养基上，5～7 d后观察菌落数量并计算再生率。

2.1影响原生质体制备的因素

2.1.1不同酶及其组合对原生质体制备的影响试验结果见表2。酶的种类对原生质体释放影响很大，当用溶壁酶单独处理玉米丝轴黑粉菌担孢子时，原生质体得率很低。即使延长酶解时间至180 min，原生质体得率也仅为5.33%。

两种酶液混合处理的原生质体得率虽然有所提高，但是提高不多，原生质体得率为10%左右。用5 mg/mL溶壁酶、20 mg/mL崩溃酶和20 mg/mL蜗牛酶3种酶混合处理丝轴黑粉菌60 min时，原生质体得率为57.06%，与单一酶和两种酶处理相比显著提高。5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶、50 mg/mL蜗牛酶3种酶的混合液为制备玉米丝轴黑粉菌原生质体的最佳酶组合，酶解10 min原生质体得率为99.36%。制备得到的原生质体外观见图1。

2.1.2不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响由于原生质体对渗透压敏感，合适浓度的稳渗剂可以维持原生质体的内外渗透压平衡。因此，稳渗剂的种类和浓度也非常关键。分别选用3种不同含量NaCl、MgCl2、KCl、山梨醇、蔗糖配制5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶、50 mg/mL蜗牛酶3种酶的混合液，观察渗透压稳定剂对原生质体产量的影响。结果见表3。

结果表明，1.0 mol/L蔗糖作为稳渗剂原生质体产量最高，1.0 mol/L山梨醇次之，为1.35×108个/mL。无机稳渗剂效果较差，原生质体之间容易融合成堆，说明无机物不适合用作玉米丝轴黑粉菌原生质体制备的稳渗剂。从原生质体产量和聚集情况综合考虑，确定以1.0 mol/L山梨醇作为稳渗剂制备玉米丝轴黑粉菌原生质体。

2.1.3菌龄对原生质体制备的影响细胞壁的成分和结构在细胞的不同生长时期有所不同，导致细胞壁对溶壁物质敏感性的差异。将活化培养3 d后的菌液以1/20的接种量扩大培养，收集不同时间段的担孢子，以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶、50 mg/mL蜗牛酶3种酶混合液酶解，结果见图2。从图2可见，24 h为玉米丝轴黑粉菌扩大培养最佳菌龄时间，此时细胞壁最敏感，制备原生质体得率最高。此后随培养时间延长原生质体得率降低。

2.1.4酶解时间对原生质体制备的影响酶解时间也是影响原生质体得率的重要因素之一，在酶解5、10、15、20、25 min时测定原生质体的得率，结果见图3。由图3可知，酶解10 min时，原生质体的得率最高，达99.36%。此前随着酶解时间的延长，原生质体的得率增加；此后随着酶解时间的延长，原生质体的得率有所下降。

2.1.5酶解温度对原生质体制备的影响酶解温度对原生质体得率的影响试验结果见图4。由图4可见，28 ℃为酶解的最适温度，超过或低于28 ℃原生质体得率明显下降。

2.2原生质体的再生情况

酶的组合和酶解时间对原生质体再生有一定的影响（表5）。酶浓度低，需要的处理时间长，会使先形成的原生质体破裂，造成再生率低。

3小结与讨论

试验研究了玉米丝轴黑粉菌孢子原生质体的制备和再生条件，结果表明，菌株SR1活化3 d后以1/20的接种量继续培养24 h，离心收集的菌体加入5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶、50 mg/mL蜗牛酶混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min摇床上酶解10 min，原生质体得率为99.36%，以山梨醇为稳渗剂产量可达1.35×108个/mL，再生率为35.63%。

玉米丝轴黑粉菌为担子菌亚门病原真菌，其担孢子细胞壁主要成分是几丁质（几丁聚糖）和葡聚糖，用单一酶如蜗牛酶、溶壁酶、崩溃酶，都不能完全降解细胞壁以产生足够的原生质体[5-8]。蜗牛酶虽然是复合酶，可能是由于所含酶的种类关系，更适合于降解含有较多葡聚糖的真菌。崩溃酶作为另外一类复合酶，在多种植物病原真菌的原生质体制备中得到应用[9]，但单独使用对玉米丝轴黑粉菌孢子酶解作用也较差，溶壁酶单独使用效果也不理想。这说明玉米丝轴黑粉菌孢子的细胞壁成分比较特殊，很难用一种通用酶去除。试验中，2种以上酶混合作用于玉米丝轴黑粉菌孢子可获得较高的原生质体得率，用5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩溃酶和50 mg/mL蜗牛酶混合作用可使孢子在短时间内完全溶壁。制备真菌的原生质体时浓度适宜的混合酶较单一酶更好，这个结论与前人的研究结果一致[10，11]。在酶解时间对原生质体的影响试验中，镜检可观察到原生质体在酶液中随时间延长逐渐减少，后续试验中再生率也有所降低，可见酶对原生质膜有一定破坏作用。酶浓度提高时，所含其他杂酶也相应提高，更容易破坏原生质体并影响其活性。

试验中有机化合物作为稳渗剂效果要比无机化合物好，这与前人报道一致[8]。无机化合物作为稳渗剂容易使原生质体发生聚集，这种情况可能会影响到后续的再生和转化。

菌体能否产生大量活性高的原生质体与菌体本身的生理状态有一定的关系。酶的作用受菌龄的影响，菌龄过大菌体的细胞壁老化增厚，酶解难度增加，原生质体释放难度较大；通过大幅增加酶解时间菌体更容易释放原生质体，但是原生质体容易破裂且不容易再生，所以掌握菌龄对于制备原生质体非常重要。在酶浓度与酶解时间这两个因素当中，酶解时间对再生的影响较大。随着酶解时间延长，原生质体再生能力下降。

参考文献：

[1] 王振华，姜艳喜，王立丰，等.玉米丝黑穗病的研究进展[J].玉米科学，2002，10（4）：61-64.

[2] 倪深，肖炎农，王凤格，等.基于PCR技术的玉米丝轴黑粉菌侵染率及扩展进程的研究[J].中国农业科学，2006，39（9）：1804-1809.

[3] 王振华，刘长华，张林，等. 玉米丝黑穗病苗期快速鉴定方法[J].植物保护，2009，35（6）：99-103.

[4] 李莉，贾立辉，朴红梅，等. 玉米抗丝黑穗病的研究进展[J]. 玉米科学，2008，16（6）：136-138.

[5] 王杰，林俊芳，云慧，等. 草菇原生质体制备、再生及转化研究[J]. 华南农业大学学报，2007，28（3）：119-121.

[6] 李芳莲，闫晓星.绿粘帚霉原生质体制备和再生条件的研究[J]. 四川农业大学学报，2008，26（2）：149-153.

[7] 詹萍，苏龙，周乃东.红酵母原生质体制备和再生条件研究[J].安徽农业科学，2010，38（3）：1154-1155，1172.

[8] 薛伟，赵筱萌，刘素花，等.桃褐腐病菌（Monilia fructigena）原生质体制备及再生条件[J].微生物学通报，2010，37（1）：71-77.

[9] THON M R， NUCKLES E M， VAILLANCOURT L J. Restriction enzyme mediated integration used to produce pathogenicity mutants of Colletot richum Graminicola [J]. Mol Plant Microbe Interact，2000，13（12）：1356-1365.

[10] GALLMETZER M， BURGSTALLER W， SCHINNER F. An optimized method for the isolation of protoplasts from Penicillium simplicissimum to produce sealed plasma membrane vesicles[J]. Mycologia，1999，91（1）：206-212.

[11] LI W J， ZHENG Y X， WANG H Z， et al. Protoplast formation and regeneration of gibberellin-producing strains of Gibberella fujikuroi[J]. Acta Mycol Sin，1992，11（3）：221-228.