利用Mlo蛋白质保守域MJ4—MrcD2区扩增小麦抗白粉病基因

贾倩　李东方等

摘要：利用Ｍｌｏ蛋白质保守域设计兼并引物，以２４个抗性不同的小麦品种为试验材料，采用抗病基因类似物（ＲＧＡ）法探索小麦白粉病抗病基因快速有效筛选及利用的新方法。结果表明，所用的小麦抗病材料基因组ＤＮＡ与兼并引物同源区的序列变化较感病材料大，导致扩增效率较低；兼并引物在抗病及感病材料中扩增结果类似，仅从这一结果无法判断扩增出的ＲＧＡ与小麦白粉病基因间的关系，需要通过下游转化、克隆、测序来进一步筛选抗病相关ＲＧＡ。

关键词：白粉病；Ｍｌｏ蛋白质；保守域；抗病基因类似物（ＲＧＡ）

中图分类号：Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5798-03

小麦白粉病是小麦生产上的重要病害。利用抗病品种是防治小麦白粉病最经济有效的措施。培育、推广不同来源的抗性基因聚合体品种或将抗性基因不同的品种进行合理布局，避免抗源单一化，可以有效地减缓小麦白粉病菌优势菌株的繁殖速度和延缓品种抗性丧失的速度［１］。因此，如何获取新抗源是小麦白粉病抗病育种的关键。大麦中隐性突变基因Ｍｌｏ介导了一类单基因控制的、非小种专化的、持久的白粉病抗性［２］，是获取新抗源的又一重要途径。

试验通过对Ｍｌｏ蛋白质保守域ＭＪ４－ＭｒｃＤ２区的扩增来获得小麦抗白粉病基因，为寻找快速有效的抗白粉病基因新筛选方法及其在作物育种上的有效利用提供技术支持。

１ 材料与方法

１．１ 材料

试验选用的小麦材料见表１。

１．２ 方法

１．２．１ 兼并引物的设计 根据来自普通小麦、大麦、玉米、粳稻、籼稻等物种的８个Ｍｌｏ基因所编码蛋白质的跨膜区保守域设计兼并引物（所依据的保守域见表２，序列比对所用基因编码的蛋白质见表３），采用的数据库及序列分析比对软件有ＣＤＤ、CｌｕｓｔａｌＸ１．８、Pｒｉｍｅｒ５．０等。

１．２．２ 小麦基因组ＤＮＡ的提取 采用ＣＴＡＢ法。

１．２．３ ＰＣＲ扩增及电泳 ＰＣＲ体系采用２０μＬ：ＤＮＡ模板１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，ｄＮＴＰｓ２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１２．６μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４μＬ，上下游引物各１μＬ。ＰＣＲ循环参数：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃退火１．５ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，４０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃，保存。采用１．２％琼脂糖凝胶进行电泳，缓冲液为１×ＴＡＥ；电泳结果用凝胶成像系统进行拍照，保存。

２ 结果与分析

由图１和图２可知，抗病材料中除１、２、３、５、６没有扩增出结果外，７、８、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２３、２４都扩增出了目标条带，抗病材料中能扩增出目标条带的频率是６６．７％（１０／１５）；感病材料４没有扩增出结果，９、１０、１１、１６、１７、１９、２１、２２中都扩增出了目标条带，感病材料中能扩增出目标条带的频率是８８．９％（８／９）。所有目标扩增带大小都在５００ｂｐ左右，基本符合兼并引物设计时的预期结果。研究中兼并引物在抗病材料中扩增效率较低而在感病材料中扩增效率较高的事实，暗示试验所用小麦感病材料的基因组ＤＮＡ与兼并引物序列的同源区序列相似性要高于抗病材料，或者说抗病材料基因组ＤＮＡ与兼并引物同源区序列变化较大导致扩增效率较低。

通过植物抗病（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｒ）基因的保守域扩增ＲＧＡ的主要目的是分离植物的抗病基因或作为分子标记跟踪抗病基因。ＲＧＡ与Ｒ基因的关系可分为３种：ＲＧＡ是Ｒ基因或其假基因的一部分；ＲＧＡ与Ｒ基因紧密连锁；ＲＧＡ与已知的Ｒ基因无关［３］。兼并引物在抗病及感病材料中扩增结果类似，仅从这一结果无法判断扩增出的ＲＧＡ与小麦白粉病基因间的关系。由于兼并引物序列的兼并性，其在不同小麦材料中即使扩增产物大小一致但序列应该是不一样的。可以对试验中得到的扩增片段进行回收，然后进行测序及序列比对分析验证。从每个回收的扩增带转化的单克隆中挑选多个（１０～２５个）进行测序应该能找到抗病品种中所特异出现的序列，该序列很有可能是抗病基因的一部分或与抗病基因紧密连锁。这为进一步克隆抗病基因或进行抗病基因分子标记筛选打下了坚实基础。

３ 讨论

在不同抗源材料中全面发掘新抗源，培育积累不同类型的植物抗病（Ｒesistance，R）基因尽可能多的小麦新品种；或者在农作物生产上保证多样性抗源使具有不同Ｒ基因的品种合理布局，以Ｒ基因的遗传多样性来抑制新毒性小种的产生和蔓延，这些措施对于加快小麦新抗病品种培育及提高抗病品种的抗性持久性有重要意义［４－６］。研究表明，Ｒ基因具有特殊的保守域，通过保守域扩增抗病基因类似序列（ＲＧＡ）是分离植物抗病基因的重要途径，也是筛选抗病基因分子标记的重要手段［７］。保守域扩增中简并引物的设计是关键，简并度越低，产物特异性越强，但扩增效率会随之降低；反之，简并度越高，扩增效率越高，但产物的特异性会降低，简并度的大小需要根据不同抗病基因及其具体的保守域位点来确定。

大麦Ｍｌｏ基因与以往克隆的任何Ｒ基因的结构都没有同源关系，是一类植物所特有的新型的抗病基因［２］。Ｋｉｍ等［8］克隆了水稻Ｍｌｏ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＭｌｏ，ＯｓＭｌｏ）基因，并阐明ＯｓＭｌｏ编码一个６２ｋｕ的蛋白质，其功能也是负向调节广谱抗病性与叶细胞死亡。研究采用类似ＲＧＡ法，以Ｍｌｏ蛋白质保守域ＭＪ４－ＭｒｃＤ２区为目标，通过ＰＣＲ扩增来获得小麦新的抗白粉病基因，获得了初步结果，可以为寻找快速有效的抗白粉病基因新筛选方法及其在作物育种上有效利用提供一定的参考。

参考文献：

［１］韩德俊，曹 莉，陈耀锋，等．植物抗病基因与病原菌无毒基因互作的分子基础［Ｊ］．遗传学报，２００５，３２（１２）：１３１９－１３２６．

［２］韩德俊，李振岐，曹 莉，等．大麦抗白粉病基因Ｍｌｏ的研究进展［Ｊ］．西北植物学报，２００３，２３（３）：４９６－５０２．

［３］秦跟基，李万隆，陈佩度．植物抗病基因结构特征及其类似序列的研究进展［Ｊ］．南京农业大学学报，１９９９，２２（３）：１０２－１０７．

［４］陈晓梅，郭顺星．ＲＧＡ植物抗病性物质的研究进展［Ｊ］．植物学通报，１９９９，１６（６）：６５８－６６４．

［５］徐冰强，杜中军，黄俊生．ＲＧＡ法克隆候选抗病基因的研究进展［Ｊ］．分子植物育种，２００４，２（３）：４２１－４２８．

［６］李春来，张怀渝．植物抗病基因同源序列（ＲＧＡ）研究进展［Ｊ］．分子植物育种，２００４，２（６）：８５３－８６０．

［７］ＫＯＮＧＷ，ＦＡＮＧＸＪ．ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆＮＢＳ－ＬＲＲｔｙｐｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅａｎａｌｏｇｓｉｎｃｏｔｔｏｎ（ＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅＬ１）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２００３，１（３）：４２７－４２９．

［８］KIMMC，LEESH，KIMJK，etal．Mlo，amodulatorofplantdefenseandcelldeath，isanovelcalmodulin-bindingprotein.［Ｊ］．TheJournalofBiologicalChemistry，２００2，22７（２2）：19304－19314．