绿色荧光蛋白在贵阳腐霉的组成性表达

刘萍　郑慧玲　吴建伟　苏晓庆

摘要：以潮霉素抗性基因ｈｐｈ为筛选标记，以双元载体ｐＰＫ２为基本骨架，将增强型绿色荧光蛋白基因ｅｇｆｐ置于组成型启动子ＰｇｐｄＡ和色氨酸Ｃ终止子ＴｔｒｐＣ之间，构建了组成性表达ｅｇｆｐ的载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ，利用根癌农杆菌介导的遗传转化法，转入贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）表达。对转化子进行ＲＴ－ＰＣＲ和荧光显微镜检测，结果表明，ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉转化子中能稳定表达。

关键词：贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）；基因转化；绿色荧光蛋白；根癌农杆菌

中图分类号：Ｑ７８６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5801-03

贵阳腐霉（Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ）是贵阳医学院苏晓庆教授于１９９４年分离得到的一株灭蚊真菌［１］。经研究证实它具有灭蚊能力较强、繁殖速度快、易于人工培养［２］和可移植性强以及对非靶生物相对安全等诸多优点［３，４］。由于昆虫病原真菌广泛存在于自然界，真菌制剂一旦释放到自然环境中，需要准确鉴别染病昆虫是否为人工释放的菌株制剂所致，而在真菌制剂中引入安全、可靠的遗传标记则为其提供了可能。增强型绿色荧光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强３５倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，通过与目标基因融合，可进行真菌的细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记、突变体致病力检测、生态学行为以及与其他生物互作等研究，因此是目前标记研究真菌的重要手段之一。此次研究以贵阳腐霉菌丝体为受体材料，利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术将含ｅｇｆｐ的表达载体转入贵阳腐霉，以获得带有ＥＧＦＰ标记的贵阳腐霉菌株，为研究其对蚊幼虫的入侵过程以及两者之间的互作模式打下基础。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．３ 引物 试验所用引物序列见表１。

１．２ 方法

１．２．１ ｅｇｆｐ组成性表达载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的构建 用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ酶切质粒ｐＳＫ－ｈｐｈ，回收ＴｔｒｐＣ片段（７７０ｂｐ），与用相同酶切的质粒ｐＵＣ１８连接转化，重组载体命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ。以质粒ｐＥＧＦＰ－Ｃ１为模板，pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２为引物，ＰＣＲ扩增ｅｇｆｐ基因片段，用ＢａｍＨⅠ和 ＢｇｌⅡ双酶切后纯化回收，与同样双酶切的ｐＵＣ1８－ＴｔｒｐＣ连接，转化验证，命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ。以质粒ｐＡＮ７－１为模板，用引物ＰｇｐｄＡ１和ＰｇｐｄＡ２ＰＣＲ扩增ＰｇｐｄＡ基因片段，用ＫｐｎⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后纯化，回收该目的片段，与经过相同双酶切的载体ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ连接，命名为ｐＵＣ１８－ＴｔｒｐＣ－ＥＧＦＰ－ＰｇｐｄＡ，提取其质粒，用ＨｉｎｄⅢ酶切后电泳，凝胶回收３．６ｋｂ的大片段ＰｇｐｄＡ－ＥＧＦＰ－ＴｔｒｐＣ，与相同酶切的质粒ｐＰＫ２连接，筛选阳性转化子，用ＢａｍＨⅠ单酶切验证，得到正向连接的转化子为质粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ。

１．２．２ ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４转化 采用冻融法［５］。

１．２．３ 根癌农杆菌介导的ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉的遗传转化 按龙朝钦等［６］的方法稍改动。取含质粒ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的ＬＢＡ４４０４过夜培养物，用含２００μｍｏl／ＬＡＳ的ＹＥＰ液体培养基于２８℃振荡培养６ｈ后，与贵阳腐霉菌丝混合，于２６℃培养１ｄ。弃上清，加入５００μＬＩＭ液体培养基（含２００μｍｏl／ＬＡＳ），于２６℃培养２ｄ。悬浮沉淀，将该混合物涂布到ＫＰＹＧ２平板上（含２００ｍｇ／Ｌ潮霉素Ｂ和２００ｍｇ／Ｌ头孢霉素），于２６℃培养直至抗性菌丝长出。

１．２．４ 转化子的ＲＴ－ＰＣＲ检测 贵阳腐霉及转化子总ＲＮＡ的提取采用ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）提取。用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＲｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）逆转录并去除基因组ＤＮＡ。以pＥＧＦＰ１和pＥＧＦＰ２为引物，利用ＰＣＲ对得到的抗性菌落进行分子验证，扩增ｅｇｆｐ基因片段。

１．２．６ 荧光的观察 临时制片，利用Ｏｌｙｍｐｕｓ荧光显微镜在波长４８０ｎｍ下进行荧光观察、照相。

２ 结果与分析

２．１ ｅｇｆｐ组成性表达载体ｐＰＫ２－ＥＧＦＰ的构建与酶切验证结果

２．２ 组成性表达ｅｇｆｐ重组菌株的筛选与验证

２．３ 贵阳腐霉转化株ｅｇｆｐ的荧光检测

３ 讨论

绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）来源于海洋生物水母Ａｅｑｕｏｒｅａvｉｃｔｏｒｉａ，其作为报告基因已被广泛地应用于丝状真菌生物学研究中。２００９年，ＤｅＳｉｌｖａ等［７］将带ＥＧＦＰ标记的植物病原真菌Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ接种４种植物宿主，通过对荧光的直接定量研究它对不同植物的损害情况。２００８年，Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ等［８］将带有ＥＧＦＰ标记的曲霉菌接种到棉花种子中，利用ＥＧＦＰ标记监测真菌的生长、侵染途径、定殖以及黄曲霉毒素的产生。另外，Ｈｕ等［９］利用含有ＥＧＦＰ的金龟子绿僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）基因重组菌株，研究在植物根际不同深度土壤中，昆虫、植物和真菌三者之间的相互作用。金凯等［１０］将组成性表达ｅｇｆｐ的球孢白僵菌转化株接种菜青虫，利用冰冻切片和荧光显微观察技术可清楚地检测到病原菌在昆虫体表附着、菌丝穿透体壁以及菌丝从寄主体内长出等侵染过程。牛秋红等［１１］也构建了含ｅｇｆｐ的重组质粒，转化粉红粘帚霉，为研究真菌侵染机理的模型打下了试验基础。

贵阳腐霉是一种重要的昆虫病原真菌，开发其真菌制剂用于蚊虫的生物防治很有价值。ＲＴ－ＰＣＲ和荧光显微检测显示，ｅｇｆｐ基因在贵阳腐霉中已稳定表达，生物测定试验也表明，具有较强荧光的转化子的毒力与野生菌株相比没有明显改变。这一新的活体报告基因将在贵阳腐霉的侵染过程研究、基因调控、信号转导及发育生物学和细胞生物学等多个领域中有更广泛的应用。

参考文献：

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［２］ＨＵＡＮＧＳＷ，ＳＵＸＱ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｎＰｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ，ａｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｍｏｓｑｕｉｔｏｌａｒｖａｅ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，２００７，２６（３）：３８０－３８８．

［３］刘 萍，苏晓庆．灭蚊真菌贵阳腐霉Ｐｙｔｈｉｕｍｇｕｉｙａｎｇｅｎｓｅ对大鼠的长期安全性测试［Ｊ］．菌物学报，２００７，２６（３）：４４０－４４７．

［４］刘 萍，苏晓庆．灭蚊真菌贵阳腐霉对几种动物的急性安全性测试［Ｊ］．贵阳医学院学报，２００７，３２（４）：３３１-３３６．

［５］张边江，陈全战．质粒导入不同种农杆菌冻融法的探讨［Ｊ］．湖北农业科学，２００７，４６（３）：３２９-３３１．

［６］龙朝钦，邓 军，郝 飞，等．根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件的优化［Ｊ］．西部医学，２００８，２０（２）：２６１-２６４．

［７］ＤＥＳＩＬＶＡＡＰ，ＢＯＬＴＯＮＭＤ，ＮＥＬＳＯＮＢＤ．ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍｗｉｔｈｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｆｈｙｐｈａｅｉｎｆｏｕｒｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｈｏｓｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００９，５８（３）：４８７－４９６．

［８］ＲＡＪＡＳＥＫＡＲＡＮＫ，ＣＡＲＹＪＷ，ＣＯＴＴＹＰＪ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＧＦＰ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓｓｔｒａｉｎｔｏｓｔｕｄｙｆｕｎｇａｌｉｎｖａｓｉｏｎ，ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ，２００８，１６５（２）：８９－９７．

［９］ＨＵＧ，ＳＴＬＥＧＥＲＲＪ．Ｆｉｅｌｄｓｔｕｄｉｅｓｕｓｉｎｇａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｍｙｃｏｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）ｒｅｖｅａｌｔｈａｔｉｔｉｓｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｃｏｍｐｅｔｅｎｔ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８（１２）：６３８３-６３８７．

［１０］金 凯，张永军，罗志兵，等．利用ＧＦＰ表达系统检测球孢白僵菌侵染昆虫过程［Ｊ］．菌物学报，２００８，２７（３）：３７７-３８４．

［１１］牛秋红，柯 涛，张 林，等．适用于粉红粘帚霉绿色荧光标记的重组质粒的构建及应用［Ｊ］．微生物学报，２０１１，５１（７）：９９１－９９７．