富甘氨酸果蝇抗菌肽SK66的抗菌机制研究

冯志国　刘慧娟　李涛　陈正望

摘要：为了研究ＳＫ６６的抗菌机制，对Ｋ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６进行序列比对和分析，结果发现Ｔｒｘ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了１个Ｔｒｘ蛋白，ＡＭＡ－ＳＫ６６是ＳＫ６６的氮端加了２个丙氨酸和１个甲硫氨酸，ＳＫ６６－ｈｉｓ是在ＳＫ６６的碳端加了６个组氨酸；比较ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６杀灭细菌活性，结果表明Ｔｒｘ－ＳＫ６６没有杀菌活性，ＡＭＡ－ＳＫ６６杀菌活性大大降低。试验结果说明氮端氨基酸对ＳＫ６６杀菌活性很重要，尤其氮端氨基酸的极性。

关键词：抗菌肽ＳＫ６６；果蝇；富甘氨酸抗菌肽；抗菌机制

中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5662-03

昆虫不具备特异性免疫系统，其利用自身产生的各种昆虫抗菌肽来应对损伤和感染［１］。昆虫抗菌肽种类繁多，不同抗菌肽的作用机制不同。根据抗菌肽作用于细胞部位的不同，可以将其大体分为两类，一类是直接作用于微生物细胞膜的杀伤模式，抗菌肽首先通过静电结合被吸引到细胞表面，到达质膜后与脂质双分子层相互作用。目前已提出桶－板模型［１］、毯式模型［２］、环形孔模型［３］等多种模式来解释抗菌肽的膜穿透活性。另一类为作用于靶点的细胞内杀伤模式。抗菌肽被转入胞浆，能够通过改变质膜隔膜形成、抑制细胞壁合成、抑制核酸合成、抑制蛋白质合成或抑制酶活性以达到杀菌的目的［４］。

富含甘氨酸（Ｇｌｙ）的抗菌肽的共同特点是一级结构中含甘氨酸，有些是全序中富含甘氨酸［５］，如鞘翅肽（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒｉｃｉｎ）、半翅肽（Ｈｅｍｉｐｔｅｒｉｃｉｎ），有些是某一结构域中富含甘氨酸［６］，如双翅肽（Ｄｉｐｔｅｒｉｃｉｎ）、麻蝇毒素Ⅱ（ＳａｒｃｏｔｏｘｉｎⅡ）、凝集素（Ａｔｔａｃｉｎ）等，都至少有１个富含甘氨酸的结构域。果蝇抗菌肽ＳＫ６６结构域中富含甘氨酸［７－１０］，试验通过对ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６和Ｔｒｘ－ＳＫ６６的杀菌活性比较，试图为富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６的抗菌机制研究提供基础资料。

１ 材料与方法

１．１ 材料

苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｇ＋），华中农业大学生命科学与技术学院微生物学实验室提供；金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ，Ｇ＋）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｇ－）、枯草杆菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｇ＋）、铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｇ－）由华中科技大学校医院提供。

ＳＫ６６－ｈｉｓ、ＡＭＡ－ＳＫ６６、Ｔｒｘ－ＳＫ６６为华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室保存。

１．２ 方法

１．２．１ 功能结构域预测 用ＤＮＡｍａｎ和ＧｅｎｅＣａｒｄ软件进行ＣＧ１３５５１序列分析并进行功能结构域预测。

１．２．２ 最低杀菌浓度（ＭＢＣ）测定 采用微量液体检测法，参照最低抑菌浓度测定法改进。待测样品溶于无菌生理盐水，并作系列二倍稀释。将培养到对数生长期的待测菌用无菌生理盐水稀释，调整菌液为２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，将此菌液与等体积的抗菌肽样品溶液混合均匀，对照为无菌生理盐水。３７℃保温６０ｍｉｎ后取４μＬ点种于空白培养基上，室温放置３０ｍｉｎ后３７℃倒置培养过夜后观察。以没有长出菌落的对应样品的终浓度为该样品对该菌的最低杀菌浓度。当对照组长出密集菌落５ｈ后，样品组只长出少量菌落的则认为该样品有抑菌能力。

２ 结果与分析

２．１ 富甘氨酸抗菌肽ＳＫ６６氨基酸序列比对和分析

３ 小结与讨论

果蝇作为模式生物对研究动物免疫起了重要作用。目前在黑腹果蝇体内已发现了８种抗菌肽，分别为樗蚕素［５］、天蚕素（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）［６］、防御素（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）［７］、果蝇抗真菌肽（Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）［５］、果蝇肽（Ｄｏｒｓｏｃｉｎ）［５］、双翅肽［１１］、碧蝽金属肽（Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｗｉｎ）［１２］和在雄性果蝇的射精囊中特异表达的Ａｎｄｒｏｐｉｎ［１３］，这些抗菌肽对特定微生物有较强的杀菌作用。

参考文献：

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［９］冯志国，刘慧娟，郎 君，等．一新富含甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的优化表达［Ｊ］．生物技术，２００８，１８（４）：１８－２０．

［１０］冯志国，郎 君，李燕娇，等．富甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的直接表达和纯化［Ｊ］．生物技术通报，２００９（３）：８８－９０．

［１１］ＤＩＭＡＲＣＱＪＬ，ＨＯＦＦＭＡＮＮＤ，ＭＥＩＳＴＥＲＭ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｆｉｌｅｏｆａＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａｎｉｎｓｅｃｔｄｅｆｅｎｓｉｎ．Ａｓｔｕｄｙｉｎｉｎｓｅｃｔｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２２１（１）：２０１－２０９．

［１２］ＨＯＦＦＭＡＮＮＪＡ．ＴｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２６（６９６２）：３３－３８．

［１３］ＤＡＴＥＡ，ＫＡＳＡＨＡＲＡＫ，ＳＡＷＡＩＨ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｒｏｐｉｎｇｅｎｅｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ［Ｊ］．Ｊ ＭｏｌＥｖｏｌ，２００２，５４（５）：６６５－６７０．