莱克多巴胺免疫抗原与多克隆抗体的制备

申宏丹　王记莲

摘要：采用碳化二亚胺－Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＥＤＣ－ＮＨＳ）法将莱克多巴胺（ＲＡＣ）与活化的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）偶联，合成了免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），经聚丙烯酰胺凝胶电泳法和紫外吸收法鉴定偶联成功。用合成的免疫抗原免疫家兔获得了高效价的多克隆抗体，采用所得抗体和辣根过氧化酶标抗原建立莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附分析法（ELISA），标准曲线呈典型Ｓ型，具有良好的线性关系。

关键词：莱克多巴胺；抗原；抗体；酶联免疫吸附分析法（ELISA）

中图分类号：Ｓ８５９．８４ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5736-03

莱克多巴胺属于β２－兴奋剂的一种，是一类结构和功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，它可以加快畜禽的生长速度，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率。β２－兴奋剂常见的有盐酸克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇等。随着我国对盐酸克伦特罗监管力度的加大，盐酸克伦特罗的非法应用得到了有效的控制，莱克多巴胺作为其替代品，非法应用日益猖獗。由于莱克多巴胺在动物组织中残留可能对人体产生很多不利影响，所以我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局明文禁止莱克多巴胺用于动物养殖［１－４］。关于莱克多巴胺的检测方法主要有仪器检测和免疫检测两种，免疫检测法主要包括酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫芯片法以及胶体金层析法［５，６］。质量良好的抗原和抗体是免疫检测法的基本和关键条件。该试验从改进合成免疫抗原的条件入手，制备了莱克多巴胺多克隆抗体，为以后更好地开发对莱克多巴胺的免疫检测方法做好了前期探索工作，对保障我国食品安全和医疗安全等具有十分重要的意义。

１ 材料

１．１ 试剂

莱克多巴胺（ＲＡＣ）；自制酶标抗原（ＨＲＰ－ＲＡＣ）；琥珀酸酐；弗氏不完全和完全佐剂；吡啶；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）；卵清蛋白（ＯＶＡ）；甲醇；二氯甲烷；氨水；对乙基－Ｎ，Ｎ－二甲基丙基碳二亚胺（ＥＤＣ）；氮－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）；Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）；乙二胺（ＥＤＡ）；磷酸盐缓冲液（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）。

１．２ 仪器设备

酶标仪（ＤＮＭ－９６０２型，北京普朗新技术有限公司）；旋转蒸发仪（ＲＥ－５２Ａ型，上海亚荣生化仪器厂）；薄层层析板（GF2541型，青岛海洋化工厂）；紫外－可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；红外光谱仪（FTS-135型，巩义市英山谷予华仪器厂）；真空冷冻干燥器（美国Bio-Rad公司）；自动双重纯水蒸馏器（上海申胜生物科技有限公司）；离心机（ＴＧＬ－１６型，上海安亭科学仪器厂）；电泳仪（ＤＹＹ－６Ｃ型，北京六一仪器厂）；电泳槽（ＤＹＣＥ－２４ＥＮ型，北京六一仪器厂）。

２ 方法

２．１ 牛血清白蛋白（ｃＢＳＡ－ＮＨ２）的活化

准确称取２７ｍｇＥＤＡ溶解于２０ｍＬＰＢＳ中，用ＨＣｌ调节ｐＨ至７．４，制成Ａ液。依次称取１．５ｇＢＳＡ、８４ｍｇＥＤＣ溶解于２０ｍＬＰＢＳ中，制成Ｂ液。将Ｂ液缓慢加入到Ａ液中，室温搅拌反应２ｈ，将反应液转移到半透膜中，４℃用ＰＢＳ透析３ｄ，４～６ｈ换一次透析液，透析完毕，用真空冷冻干燥机冻干，得到白色絮状固体，－２０℃保存，备用。

２．２ 莱克多巴胺免疫抗原的制备与鉴定

采用改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法［７］合成免疫抗原（ＲＡＣ－ＢＳＡ），称取３４ｍｇ盐酸莱克多巴胺和１０ｍｇ琥珀酸酐溶解于２ｍＬ无水吡啶中，在磁力搅拌器下搅拌反应至完全。反应物经旋转蒸发除去吡啶，用三氯甲烷萃取除去未完全反应的琥珀酸酐，得到纯的莱克多巴胺半琥珀酸酐酯（ＲＡＣ－ＨＳ），真空冷冻干燥后得到干态的ＲＡＣ－ＨＳ。将ＲＡＣ－ＨＳ溶解于１ｍＬ１０％ＤＭＦ溶液中，分别加入一定量的ＥＤＣ和ＮＨＳ，室温避光振荡活化一段时间，加入β－巯基乙醇淬灭多余的ＥＤＣ。加入一定量活化的ＢＳＡ，室温反应一段时间后，加入盐酸羟胺淬灭未反应的ＮＨＳ，透析纯化得到偶联物。采用紫外全波长扫描法和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法对免疫抗原的偶联比进行鉴定。

２．３ 莱克多巴胺多克隆抗体的制备与直接竞争ELISA的建立

初次免疫用注射器对抽法将弗氏完全佐剂与免疫原按1∶1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射０．５ｍｇ免疫原，背部皮下多点注射（５～１０点）。两周后进行二免采用弗氏不完全佐剂，剂量、方法同首免。以后每隔两周加强免疫一次，剂量减半。从第三次免疫开始，每次免疫７ｄ后，耳缘静脉采血０．２ｍＬ，室温凝固２ｈ后４℃过夜，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，分离血清。检测抗血清效价，阴性兔血清作为对照，当抗血清效价基本不变时，不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，７ｄ后进行颈动脉采血。血液在４℃静置过夜，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，分离上清液，即抗血清。抗血清采用硫酸铵盐析法初步纯化，初步获得的抗血清再通过ＰｒｏｔｅｉｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ法继续纯化［８，９］，纯化抗体冷冻干燥后－２０℃保存。用方阵法确定酶标抗原ＲＡＣ－ＨＲＰ与多抗的最佳工作浓度，建立莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附法，操作步骤见文献［１０］。

３ 结果与分析

３．２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定免疫抗原结果

电泳迁移率取决于蛋白质分子质量的大小，分子质量越小的蛋白质迁移越快。ＢＳＡ的泳动速度大于ＲＡＣ－ＢＳＡ，说明ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子质量大于ＢＳＡ，也可证明ＲＡＣ和ＢＳＡ已成功偶联。用紫外凝胶成像系统分析软件计算出ＲＡＣ－ＢＳＡ的分子质量为７．２４×１０４ｕ，ＢＳＡ的分子质量为６．６３×１０４ｕ，计算得出ＢＳＡ与ＲＡＣ的偶联比约为１∶２０，与紫外鉴定结果的偶联比基本一致。

３．３ 方阵法确定抗体、酶标物最佳工作浓度

采用常规直接竞争ＥＬＩＳＡ法测定酶标抗原和抗体的最佳工作浓度。用包被缓冲液将抗体从１０００～３２０００倍比稀释，酶标抗原从１０００～１６０００倍比稀释，实验方法见直接竞争ＥＬＩＳＡ反应步骤。以ＯＤ４５０nm为１．０左右时的稀释度为最佳值，则最佳抗体稀释度为１∶８０００，最佳酶标物稀释度为１∶２０００，结果见表２。ＯＤ值≥阴性对照孔２倍判定为阳性，阳性孔的最高稀释倍数判定为抗体效价，测得抗体效价为１∶16０００，证明所合成的免疫抗原具有免疫活性并且能产生高效价的抗体。

３．４ 直接竞争ＥＬＩＳＡ标准曲线的测定结果

４ 小结与讨论

１）ＲＡＣ是小分子物质，只有反应原性没有免疫原性，必须和大分子载体偶联后才能免疫动物产生抗体。该试验中使用的载体蛋白是牛血清白蛋白，先进行活化，用乙二胺（ＥＤＡ）进行封闭，使其只含有氨基，增加牛血清白蛋白和羧基反应的活性，提高了偶联效率。

２）在ＲＡＣ的仲胺位置成功地连接上琥珀酸酐，引进羧基，可以采用多种常规的人工抗原偶联方法。该试验中采用的是在ＥＤＣ基础上改良的ＥＤＣ－ＮＨＳ法，即在ＥＤＣ基础上，加入ＮＨＳ，可以控制蛋白质之间的交联，提高偶联反应的针对性，达到提高偶联效率的目的。在合成过程中得到了固态的中间体ＲＡＣ－ＨＳ，为今后的科学研究和工业化生产提供了很大的便利。

３）用合成的免疫抗原免疫大白兔获得了１∶16０００高效价的多克隆抗体，建立了莱克多巴胺直接竞争酶联免疫吸附法，用方阵法确定抗体最佳稀释度为１∶８000，酶标抗原最佳稀释度为１∶２０００。标准曲线有良好的线性，证明制备的免疫抗原和抗体可用，为继续深入研究莱克多巴胺的免疫学检测技术奠定了坚实的基础。

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