副猪嗜血杆菌病的防治技术研究

2012-04-29李明波张抗抗宋忠旭梅书棋

湖北农业科学 2012年24期

关键词：分型

李明波　张抗抗　宋忠旭　梅书棋

摘要：副猪嗜血杆菌病是流行于猪群的接触性呼吸道传染病，该病可以影响养猪生产的各个阶段，临床上以猪的纤维素性多发性浆膜炎、心包炎、关节炎、脑膜炎为特征。对副猪嗜血杆菌病的临床研究应该包括菌株的分离鉴定、血清和基因分型、药物和疫苗的防治研究等。

关键词：副猪嗜血杆菌病；菌株分离鉴定；分型；免疫及防治

中图分类号：Ｓ８２８文献标识码：Ｂ文章编号：0439－８114（２０12）24－5730-04

副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｓｕｉｓ，ＨＰＳ）是正常猪群呼吸道上的一种常在菌。临床上以猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、心包炎、脑膜炎为特征，该病又被称为革拉泽氏病［１］。该病目前在规模化养殖场感染率很高，且危害严重，主要引起哺乳仔猪、保育猪（３０～５０日龄）的关节肿胀、喘气、进行性消瘦、生长速度变缓、急性或慢性死亡等。副猪嗜血杆菌病的临床发病率一般在１０％～１５％，严重时病死率可达５０％，给养猪生产造成严重经济损失。不同血清型菌株之间存在毒力差异。国外特别是养猪发达国家对副猪嗜血杆菌做了流行病学调查，临床发病猪中分离率高达２０％，且流行的血清型多为副猪嗜血杆菌中毒力较强的４、５、１３型等。蔡旭旺等［２］首次鉴定了副猪嗜血杆菌分离菌株的血清型，进而建立了快速分离鉴定、培养和保存该菌的方法，并筛选出ＴＳＡ（胰蛋白大豆琼脂）固体培养基和ＴＳＢ液体培养基作为最适合该菌的培养基。同时对２００４年１２月以前分离鉴定的２８１株副猪嗜血杆菌进行了血清分型，表明中国目前流行的菌株是血清４型（２４．２％）和５型（１９．２％），其次是１３型（１２．５％）、１４型（７．１％）和１２型（６．８％），另有１２．１％的分离菌株不能进行血清学分型。

副猪嗜血杆菌病是造成猪场保育猪死亡的主要原因，在特定条件下如断奶、气候应激等因素才可侵入机体并引起严重的全身性疾病。近年来，由于免疫抑制性疾病如蓝耳病（ＰＲＲＳ）、圆环病毒２型（PCV-2）等的存在和持续性感染加剧了副猪嗜血杆菌的感染程度。

１病原学

１９１０年，Ｇｌａｓｓｅｒ首次报道了一种革兰氏阴性短小杆菌与猪的纤维素性浆膜炎和多发性关节炎之间的联系。１９２２年，Ｓｃｈｅｒｍｅｒ和Ｅｈｒｌｉｃｈ首次分离出了这种微生物，其分离培养困难。在显微镜下观察，副猪嗜血杆菌短小、无运动、多种形态，从单个的球杆菌到长的、细长的以至丝状的菌体。通常可见荚膜，但体外培养时不受影响。该菌生长只需要Ｖ因子或ＮＡＤ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），不需要Ｘ因子，属巴斯德菌科。在鲜血琼脂平板与葡萄球菌共划线培养时，呈现典型的“卫星现象”，即越靠近葡萄球菌其生长越好，远离葡萄球菌的地方不生长，并且在鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象。

ＨＰＳ具有荚膜多糖抗原和菌体结构抗原。荚膜多糖抗原成分主要是多糖和磷酸壁，具有型特异性；菌体结构抗原包括外膜蛋白（ＯＭＰ）和脂多糖（ＬＰＳ）。ＨＰＳ已知的毒力因子及潜在的毒力因子主要有荚膜、菌毛、外膜蛋白、ＬＰＳ、转铁蛋白、神经氨酸酶等。应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技术可把副猪嗜血杆菌的ＯＭＰ分为两个完全不同的生物型，即生物１型和生物２型。李静怡等［３］在ＨＰＳ中发现了２个与流感嗜血杆菌具有同源性的外膜蛋白Ｐ２和Ｐ５，该蛋白与细菌黏附有关，在毒力株和非毒力株中Ｐ２的分子质量分别为４８ｋu和５５ｋu，因此可通过Ｐ２蛋白来区分毒力株和非毒力株。ＨＰＳ的ＯＭＰ具有较好的免疫原性，Ｍｉｎｉａｔｓ等研究发现，用含有ＯＭＰ和ＬＰＳ抗原的菌苗免疫动物，有ＯＭＰ抗体的猪才能抵抗强毒菌株的感染。副猪嗜血杆菌的ＬＰＳ具有与其他革兰氏阴性菌内毒素相似的活性，而ＬＰＳ可诱导ＰＣＶ-２在体外培养的猪肺泡巨噬细胞中的复制，增加ＰＣＶ-２在细胞核内的抗原和核酸信号［４］。

Ｙｕｅ等［５］以国内分离的优势血清５型菌株ＳＨ０１６５为亲本株完成了全基因组测序，分析鉴定出了２个潜在区分强弱毒力菌株的分子靶标——ＯＭＰ２和ｓｏｄＡ基因。利用８株已测序完成的菌株全基因组序列，总结出１８个主要的毒力相关基因或操纵子基因。全基因组分析结果表明，ＳＨ０１６５菌株的基因组由２２６９１５６个核苷酸组成一个环状染色体，Ｇ＋Ｃ含量高达３９．９９％，编码２２９９个基因。基因组同源性方面，副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌遗传进化上最接近，分类上独立于嗜血杆菌属外形成一个相对独特的进化分支。

１．１血清型分型法

基于免疫扩散试验的１５种血清型已被确定。型特异性抗原为对热稳定的多糖，据推测，其可能是荚膜或脂多糖（ＬＰＳ）。副猪嗜血杆菌流行存在明显地域差异，在日本、德国、澳大利亚、美国、加拿大、西班牙和丹麦分离的血清型中显示，血清型４、５和１３最为常见。间接血凝（ＩＨＡ）试验也可用来鉴定副猪嗜血杆菌的血清型，用于弥补免疫扩散试验分型的局限性，只有６３％的菌株可以通过琼脂扩散试验鉴定血清型，相对而言ＩＨＡ可达９０％以上。目前国内建立了基于微量玻片凝集的血清学定型方法（ＮＹ／ＳＹ５４１－２００５），其基本原理是用超波破碎细菌菌体细胞后再与标准血清进行凝集反应。

１．２基因分型法

为克服副猪嗜血杆菌血清学分型的局限性，常用基因分型法对其分型，由于不同菌株具有不同的ＤＮＡ指纹图谱，基因分型主要用于鉴别菌株间的差异，其优点在于敏感性和特异性都较高，可将血清学方法不能分型的细菌进行归类。常用的基因分型有限制性内切酶指纹图谱（ＲＥＦ）、多位点酶切电泳（ＭＥＥ）、肠杆菌科基因间重复序列（ＥＲＩＣ－ＰＣＲ）、限制性酶切片段多态性分析（ＲＦＬＰ－ＰＣＲ）等。

目前国内对副猪嗜血杆菌基因分型研究较多的主要是ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ法，贾爱卿等［６］应用ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法将广东地区４８株ＨＰＳ分离株分为３１个基因亚型，归类为８个群。另３６．１％不能进行血清分型（ＫＲＧ琼脂扩散法）的菌株也得到充分分型，未发现血清分型与基因分型之间有明显的相关性，证实ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法比传统血清分型有更高的识别力，可用于场内及场间病原菌的追溯。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分型法主要针对ＨＰＳ的转铁蛋白Ａ（ｔｂｐＡ）基因和ａｒｏＡ基因进行鉴定和分类，通过ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法分析编码转铁结合蛋白基因ｔｂｐＡ对副猪嗜血杆菌进行分型，１５种副猪嗜血杆菌标准菌株可产生１２种不同的图谱，其中血清型５、１２、１４和１５具有共同的酶切图谱。ＨＰＳ相同的血清型菌株内具有遗传多样性，且血清型与ＲＦＬＰ群之间没有相关性。李军星等［７］用基于ｔｂｐＡ基因的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ的分型方法对中国６省市５７株分离菌株及１５个参考菌株进行ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，１５个血清型参考菌株分为９种基因型，５７个流行分离株可分为１５种基因型，其中在中国最为流行的基因型分别为ＤＢＮ（３８％），ＡＢＮ（１８％）与ＤＢＰ（１２％）。目前ＥＲＩＣ－ＰＣＲ和ＲＦＬＰ－ＰＣＲ基因分型法都是建立在菌株分离培养的基础上。

２流行病学

猪是副猪嗜血杆菌的天然宿主，通常可从健康猪的鼻分泌物和气管黏液中分离出细菌。还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来，正常猪肺脏是分离不出来的。全身组织器官中ＨＰＳ分离率明显高于呼吸系统组织中的ＨＰＳ分离率，临床分离ＨＰＳ时应多选择从全身性组织器官中分离。ＨＰＳ可以影响养猪生产的各个阶段，断奶前后和保育阶段发病率较高，高达４０％～５０％。咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和背毛粗乱是主要的临床症状。不同血清型菌株毒力存在差异，其中１、５、１０、１２、１３、１４为高毒力菌株；２、４、１５为中等毒力菌株；其他血清型菌株毒力较弱或没有毒力。

临床上可依据发病症状、剖检病变和细菌分离鉴定对ＨＰＳ作出常规诊断，进一步可根据１６ＳｒＲＮＡ引物序列建立的ＰＣＲ诊断方法提高检测病原的灵敏度，扩增的特异性片断为８２１ｂｐ。该方法检测的最小细菌浓度为１０２ＣＦＵ／ｍＬ，适合于从全身部位采集的病料［８］。

副猪嗜血杆菌可作为猪呼吸道疾病的病原体，也可作为一种预先影响的因素，引起肺炎的次要或主要病原体。在肺炎中，该菌只在与其他病毒或细菌协同时才引发疾病。这些病原包括支原体、猪蓝耳病病毒、猪流感病毒、呼吸道冠状病毒。ＰＲＲＳV感染的猪群中，有５１．２％的肺脏可分离到副猪嗜血杆菌和猪鼻支原体。目前临床上ＰＣＶ-２与HPS的混合感染也较为普遍。通常早期断奶的仔猪在母源抗体不存在的情况下，副猪嗜血杆菌的晚期感染可能会导致严重后果。目前在不同群体中混养猪，或引入新种猪，副猪嗜血杆菌的存在是严重问题。

３免疫与防治

３．１疫苗免疫

通过接种商业化疫苗和特异性灭活疫苗可以有效地控制该病的发生。也有使用灭活苗预防失败的事例，这可能是因为病程中出现的菌株血清型不同或疫苗接种时间控制不当缺乏交叉保护。不同菌株的免疫原性不同并且细菌的毒力可能与其免疫保护力呈正相关［８］。已证实疫苗免疫可以对相同血清型不同菌株的感染产生免疫效力。全菌灭活疫苗主要针对菌株的低脂聚糖产生同种血清型抗体，而菌体蛋白产生的体液抗体能提供高效的免疫保护，在预防ＨＰＳ感染和疾病发生中可发挥重要作用。不同血清型菌株之间的交叉保护没有一定的相关性。

国内王金合等［９］、宋凤香等［１０］报道用临床分离株制备自家疫苗对控制副猪嗜血杆菌有效；Ｍｉｎｉａｔｓ等［１１］比较了ＳＰＦ猪场中商品疫苗和自家疫苗的应用，结果表明临床分离株的自家疫苗可有效减少该猪场的发病率。对母猪和仔猪的免疫可以防止仔猪发生多发性浆膜炎和关节炎，并且母源抗体并不干扰１周龄和３周龄仔猪的免疫。免疫母猪所产的仔猪很少患肺炎和关节炎，仔猪平均日增重高于非免疫母猪所产的仔猪，也不受额外免疫的影响。蔡旭旺等［２］用国内临床分离株筛选出高毒力４、５型菌株，制备商品疫苗对母猪及１４日龄仔猪进行免疫后，具有较高的保护率，研究结果还表明母猪抗体对仔猪用灭活疫苗免疫后建立主动免疫反应的过程没有影响，这与国外研究结果一致。目前国内应用的商品苗免疫失败的还一个原因可能就是疫苗菌株与临床典型菌株血清型虽然相同，但两者基因型却不同。由于菌株致病力的差异，以及目前对保护性抗原的毒性因子缺乏深入的认识，还不可能产生一种对猪所有的致病菌株同时产生交叉免疫力的灭活苗。

在基因工程疫苗方面，副猪嗜血杆菌的４个蛋白（ＰａｌＡ、ＯＭＰ２、Ｄ１５和ＨＰＳ０６２５７）可用于ＨＰＳ疫苗的候选靶蛋白［１２］。对副猪嗜血杆菌的防控还应加强圆环病毒疫苗（目前主要流行的是ＰＣＶ２ｂ基因亚型）的免疫，特别是免疫断奶前仔猪（２～４周龄），对提高哺乳期仔猪的成活率、提高生长日增重和整齐度、降低ＰＭＷＳ的发生率和继发ＨＰＳ感染更有效。

３．２药物治疗

抗生素或口服药物治疗对严重的副猪嗜血杆菌病暴发效果不大。一旦出现临床症状，应对整个猪群注射大剂量抗生素治疗。药敏及临床试验证明大多数菌株对泰拉菌素、头孢菌素、氨苄青霉素敏感，对氟喹诺酮类、增效磺胺类药物低度敏感。对副猪嗜血杆菌病的控制方案应当包括免疫疫苗接种和抗菌素处理，但也应当加强饲养管理，如断奶仔猪饲料中添加支原净、替米考星、氟苯尼考、多西环素、电解多维、抗病毒中成药等药物；减少或根除其他呼吸道病原（多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体等）；减少猪群流动，降低寒冷、潮湿、阉割等因素造成的应激反应，杜绝生产各阶段的混养状况。

４展望

副猪嗜血杆菌病是近年来危害养猪业较大的疾病，其本身的致病机理较为复杂，为寻找对副猪嗜血杆菌病的快速诊断及有效预防和治疗方法，国内外学者对其致病机理等方面做了较深入的研究，发现了多种与副猪嗜血杆菌致病性有关的毒力因子。但其血清型众多，不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大，各毒力因子间的相互作用、毒力因子与疾病的发展关系、以及在新型疫苗研制和协同感染机制方面需做进一步的研究。特别是目前副猪嗜血杆菌常常涉及到与其他传染性疾病的混合感染，使猪的呼吸道传染病更为严重和复杂，给临床诊断和防控带来了很大的困扰。

参考文献：

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