放线菌WS—13661活性产物的快速鉴别

万中义　张亚妮等

摘要：放线菌ＷＳ－１３６６１的代谢产物对农业病原真菌具有很强的抑制活性。试验对其ＨＰＬＣ半制备组分进行生物测定，表明其活性部位在１５～２０ｍｉｎ；根据ＨＰＬＣ及ＵＶ图谱确定其活性成分为五烯类化合物，对其质谱数据进行分析确定了其分子离子峰，经数据库比对，确定其活性成分为钦氏菌素衍生物。

关键词：放线菌ＷＳ－１３６６１；天然产物；快速鉴别；钦氏菌素

中图分类号：ＴＱ４６０；Ｒ９１５ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０12）24－5658-04

放线菌产生的天然产物是生物农药研究开发的重要来源［１，２］，一方面，放线菌可直接通过发酵产生天然产物制成生物农药，如阿维菌素［３－５］、多杀菌素［６］、井冈霉素［７，８］等，另一方面，以其天然产物为模板，对天然产物结构进行优化改造，是研发高效低毒绿色农药的另一途径，如阿米西达［９］就是以真菌产生的Ｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎ［１０］为先导化合物经人工改造而获得的。然而，随着对环境中放线菌资源的不断挖掘，重复发现已知化合物的几率越来越大，获得新活性化合物的难度越来越大。据湖北省生物农药工程研究中心统计，从随机筛选工作中得到新化合物的概率在１％以下，这就说明，９９％以上的活性化合物为已知成分。因此，从大量样品中快速鉴定活性化合物成为生物农药筛选的关键。

ＷＳ－１３６６１是湖北省生物农药工程研究中心从湖南省石门地区采集的土样中分离到的一株放线菌。其发酵提取物经生物测定，对多种农业病原真菌具有较强的抑制活性。经对发酵提取物进行ＨＰＬＣ制备及自动收集，获得了不同时间流出的样品共３６份，经生物测定，确定其活性成分在１４～２１ｍｉｎ，经ＨＰＬＣ－ＭＳ分析，结合天然产物数据库比对，快速鉴定出了活性产物的化学结构。

１ 材料与方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌种 放线菌ＷＳ－１３６６１，分离自湖南省石门地区山地渣土，由湖北省生物农药工程研究中心保藏。生测用指示菌Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ、Ｓｅｐｔｏｒｉａｎｏｄｏｒｕｍ，湖北省生物农药工程研究中心提供。

１．１．２ 培养基 斜面培养基为ＩＳＰ－２琼脂培养基，１８ｍｍ×１８０ｍｍ玻璃试管每管装培养基８～１０ｍＬ。种子培养基为ＩＳＰ－２不加琼脂，５００ｍＬ带挡板三角瓶每瓶装培养基１００ｍＬ，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。发酵培养基主要成分为葡萄糖、棉子蛋白、酵母浸粉等，５００ｍＬ带挡板三角瓶每瓶装培养基１００ｍＬ，１２１℃灭菌３０ｍｉｎ。

１．１．３ 主要设备 Ｌｙ－０．８型冰冻干燥机，上海东富龙科技有限公司生产；Ｗａｔｅｒｓ高效制备色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ２５２５泵、Ｗａｔｅｒｓ２７６７自动收集系统、Ｗａｔｅｒｓ２９９６二极管阵列式检测器）；Ｗａｔｅｒｓ２６９５高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ２９９６二极管阵列式检测器）；ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏｍｉｃｒｏ质谱仪（电喷雾离子源ＥＳＩ）；ＭａｓｓｌｙｎｘＶ４．１液质联用分析软件；查普曼（Ｃｈａｐｍａｎ）天然产物数据库（２００３版）。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株摇瓶发酵 在严格无菌条件下从斜面培养基上取８～１０ｍｍ２的一块菌苔转移至种子培养基摇瓶中，２８℃１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养７２～９６ｈ，然后按１０％的接种量转接至发酵培养基中，２８℃，１５０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１００～１２０ｈ，即完成发酵。

１．２．２ 发酵液的冻干及提取 将发酵液转移至不锈钢冻干杯中，置冻干机中干燥，冻干条件为－４０℃预冻２ｈ，冷阱预冷至－４５℃以下，开启真空泵升华（真空度１０～３０Ｐａ，升温速率２～３℃／ｈ，极限温升３７℃）。取出冻干粉转移至三角瓶中，先用少量５０％甲醇湿润，再加入１００ｍＬ乙酸乙酯，于摇床上１８０ｒ／ｍｉｎ振荡萃取１ｈ，分离出酯相，旋蒸除去溶剂，再以少量甲醇溶解后送ＨＰＬＣ－ＭＳ分析。

１．２．３ 提取物的生物活性测定 取一定量发酵提取物加入ＤＭＳＯ溶解，以乙醇稀释至一定浓度后，用９６孔板进行生物测定。组分生物测定采用同样的生测靶标及方法。

１．２．５ 提取物的鉴别 根据组分生物测定结果确定活性成分的保留时间，从ＨＰＬＣ图谱中获得活性物质的紫外吸收光谱，从而确定吸收峰的波长。从ＥＳＩ图谱中可判定目标产物的分子离子峰。将吸收峰波长及相对分子质量输入Ｃｈａｐｍａｎ天然产物数据库，查询同该物质性质相同或相近的化合物名称及其化学结构，并进行理化及生物学性质比对，从而确定活性化合物的种类及其化学结构。

２ 结果与分析

２．３ ＷＳ－１３６６１活性产物的质谱分析

２．４ 活性产物的快速鉴定

３ 小结与讨论

有机化合物结构的鉴定通常需要四大谱分析，即红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振谱，红外光谱提供了化合物分子振动的信息，紫外光谱则是分子内部电子能级跃迁的结果，质谱提供了分子离子及其碎片的信息，而核磁共振谱则体现了化合物中化学键的关系。红外光谱及核磁共振谱的获得需要有一定量的纯化合物（纯度９５％以上，质量２ｍｇ以上），而放线菌活性物质纯化合物的获得需要进行发酵、提取、精制等过程，费时费力，因而采用四大谱联合进行化合物的鉴定非常耗时，一般鉴定１个化合物需要一至数月。

在微生物源天然产物资源的筛选过程中，筛选得到的绝大多数活性化合物为已知化合物，对每一种活性化合物进行四大谱分析费时费力，而分析结果多数证明是一已知化合物。因此，在筛选过程中进行化合物的早期鉴别非常重要。

多烯类化合物由于其紫外吸收光谱的特殊性，有经验的科研人员很易识别，而且根据紫外吸收峰的波长很易判断其共轭双键数目，从而确定其属于四烯、五烯还是七烯类。

在农用活性化合物的筛选工作中，多烯类化合物由于抗真菌作用强，被筛选到的几率非常大。化合物的早期快速鉴别对提高科研工作效率、降低成本具有重要意义。

参考文献：

［１］叶胜蓝，汪江峰，黄 剑．土壤放线菌Ｐ３－２的分类鉴定及抗菌活性研究［Ｊ］．生物技术通报，２０１２（１）：１５６－１６１．

［２］唐依莉，王 蓉，洪 葵．不同红树林地区老鼠簕内生放线菌的分离及其环境适应性［Ｊ］．微生物学通报，２０１２，３９（１）：２５－３２．

［３］沈寅初，杨慧心．杀虫抗生素Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ的开发及特性［Ｊ］．农药译丛，１９９４，１６（３）：１－１３．

［４］殷向东．生物源杀虫剂研究应用进展及其在我国的发展思路［Ｊ］．农药，１９９９，３８（１１）：４５－４６．

［５］OＭＵＲＡＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：４５ｙｅａｒｓｏｆｗａｎｄｅｒｉｎｇ，ｗｏｎｄｅｒｉｎｇａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０１１，６７（３５）：６４２０－６４５９．

［６］陈小龙，郑裕国，沈寅初．农用抗生素刺糖菌素（Ｓｐｉｎｏｓａｄｓ）的研究进展［Ｊ］．农药，２００２，４１（１）：４－７．

［７］沈寅初．井冈霉素研究开发２５年［Ｊ］．植物保护，１９９６，２２（４）：４４－４５．

［８］沈寅初．我国微生物源杀菌抗生素的研究开发［Ｊ］．世界农药，２０１１（４）：１－３．

［９］袁武栋．阿米西达——一种独特的生物杀菌剂［Ｊ］．四川农业科技，２００３（５）：３４．

［１０］ＡＮＫＥ Ｔ，ＯＢＥＲＷＩＮＫＬＥＲＦ．ＴｈｅｓｔｒｏｂｉｌｕｒｉｎｓｎｅｗａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｆｒｏｍｔｈｅＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅＳｔｒｏｂｉｌｕｒｕｓｔｅｎａｃｅｌｌｕｓ［Ｊ］．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９７７，３０（１０）：８０６－８１０．