小麦白粉病离体叶片法生物测定技术研究

张志刚　杨自文　王开梅　张遵霞　张亚妮

摘要：小麦白粉病是由子囊菌亚门真菌小麦白粉病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ）引起的一种世界性小麦病害。小麦白粉病菌无法在人工培养基上生长繁殖，基于植株的筛选方式难以适用于室内高通量筛选。试验通过分析小麦白粉病在室内植株上的发病特点，进行了离体叶片人工接种方法的探索，对影响小麦白粉病侵染的主要因素进行了研究，建立了基于离体叶片法和低压微量喷雾法的高通量筛选方法。利用该方法对２种抗真菌剂进行了室内生物测定试验，同时对４８０份放线菌液体摇瓶发酵提取物进行了杀菌活性筛选。结果表明，该方法能稳定、高效地进行先导化合物筛选。

关键词：小麦白粉病；人工接种；杀菌活性；叶片法筛选

中图分类号：Ｑ９３９．９５；Ｓ４３５．１２１．４＋６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5643-03

因为小麦白粉病菌（Ｂｌｕｍｅｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ，原名Ｅｒｙｓｉｐｈｅｇｒａｍｉｎｉｓ）不能在人工培养基上生长和繁殖，针对小麦白粉病的先导化合物筛选只能在植物叶片上进行。离体叶片筛选法具有省时、低消耗、用药量极少以及重复性好等优点，被作为室内高通量筛选的首选方法。通过实际筛选的检验和调整，该筛选模式从靶标培养到数据处理的整个流程已经趋于成熟。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

１．１．１ 水培法室内培养的小麦叶片 小麦种子浸种１ｄ后播种在装有营养液的塑料盆中，水培７ｄ后叶片可用于白粉病的传代培养或切割为离体叶片。水培液配方：尿素５００ｇ、磷酸二氢钾３００ｇ、硫酸钙１００ｇ、硫酸镁５０ｇ、硫酸锌０．１ｇ、硫酸亚铁０．３ｇ、硫酸铜０．１ｇ、硫酸锰０．３ｇ、硼酸０．２ｇ、水１０００Ｌ。

１．１．２ 室内培养的小麦白粉病菌孢子粉 水培７ｄ后的小麦叶片进行白粉病菌接种。接种方法为直接将白粉病菌孢子粉抖落到植株上，接种白粉病菌孢子后的小麦苗继续培养。４ｄ后叶片表面可见点状的浅色菌斑，再经过３ｄ培养，小麦叶片上便产生大量分生孢子。培养条件：温度（２０±１）℃，相对湿度４５％～６５％，光照１４ｈ／ｄ，光源为日光灯管组，光照度为３０００ｌｘ，光源距植物顶端３０～３５cm。

１．１．３ 溶剂及标准样品 溶剂为市售分析纯化学试剂甲醇、乙醇、乙酸乙酯；杀菌剂（抗真菌剂）标准样品为市售分析纯化学试剂嘧菌酯、咪鲜胺。

１．１．４ 放线菌液体摇瓶发酵提取物 放线菌液体摇瓶发酵提取物由湖北省生物农药工程研究中心制备，提取溶剂为乙酸乙酯和甲醇。

１．１．５ 主要仪器和设备 Ｂ１００－１Ｆ蠕动泵、ＨＤ－１３０美术喷笔、ＭＣＥ８ｋ电子移液器、ＤＶ８－２００移液器、人工气候室（光温湿可调）、２４孔组织培养板。

１．２ 试验方法

１．２．１ 叶片处理及不同温度小麦离体叶片的保鲜试验 预先在２４孔组织培养板中加入３ｇ／Ｌ热琼脂溶液［１］，每孔加入量为１．２ｍＬ，冷却备用。小麦叶片采下后用打孔器切取长为８ｍｍ的离体叶片（叶切片），叶切片转入２４孔组织培养板中。叶片背面向上，叶片正面紧贴培养板中已经冷却的琼脂。试验设３个培养温度（１６、２０、２５℃），比较小麦离体叶片在２４孔组织培养板中的保鲜时间。

１．２．２不同温度、湿度对小麦白粉病发病影响试验 采用直接接种小麦白粉病菌孢子的方法进行试验［２］。试验设３个培养温度（１６、２０、２５℃）和２个湿度环境（相对湿度４５％～６５％、１００％），水培７ｄ的小麦苗接种白粉病菌，记录不同温度、湿度条件下小麦白粉病发病情况。

１．２．３ 小麦白粉病菌孢子在离体叶片上的侵染试验 直接将小麦白粉病菌孢子均匀抖落接种在离体叶片上，记录小麦白粉病在离体叶片上的病情发展［３］。同时以与离体叶片同生长期的水培苗为参照。每组参照用苗２０株，接种时叶片背面向上，并标明有效接种范围。水培苗叶片与离体叶片同时接种，保证各组叶片接种孢子量相同。接种后的１２块２４孔组织培养板随机分为３组在３个不同温度（１６、２０、２５℃）培养，每个处理４个２４孔组织培养板９６个离体叶片。在光照和湿度相同的不同温度的培养室进行培养，观察并记录小麦白粉病在离体叶片上的病情发展。在菌斑出现后，随机从各离体叶片组选取２０片（２０段叶切片）离体叶片，统计叶片上病斑数；同时在参照组每株选取１段约８ｍｍ长的叶片，统计叶片上病斑数。培养条件为光照度３０００ｌｘ，相对湿度４５％～６５％。

１．２．４ 抗真菌剂离体叶片法室内生测稳定性试验［４］ 对２个抗真菌剂标准样品进行筛选稳定性试验，按目测分级法进行分级［５］。标准样品以０．０５０ｍｇ／ｍＬ为最高浓度，二倍法稀释为１２个梯度浓度。空白对照２组：第一组以乙醇－无菌水（体积比１∶１００）处理，另一组为无菌水处理。试验分２种方法进行。方法一为预防活性。取１００μｇ样品溶液进行喷雾，待叶片表面浮水干后接种白粉病菌孢子；方法二为治疗活性，先在小麦植株上接种白粉病菌孢子培养４ｄ，叶片上初现浅色菌斑时切取８ｍｍ叶片移入２４孔组织培养板中，叶片背面向上，叶片正面紧贴培养板中已经冷却的琼脂，取１００μｇ样品溶液喷雾后继续培养１０ｄ检查，根据每孔病斑数对测定物的杀菌活性进行分级。每个浓度设２个重复。培养条件为温度（２０±１）℃，相对湿度４５％～６５％，光照时间１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距２４孔组织培养板５０～６０cm。

１．２．５ 放线菌摇瓶发酵提取物的筛选试验 取１ｍＬ甲醇加入盛有提取物的样品管中，待提取物充分溶解后移入预先称重的１ｍＬ塑料样品管中，重新干燥后称重（精确到０．１ｍｇ）。根据样品量加入溶剂（乙醇，分析纯），每毫克样品加入溶剂量为０．１ｍＬ，超声波振荡１０ｍｉｎ后用无菌水稀释。定容提取物最终浓度０．２ｍｇ／ｍＬ。样品设３个梯度浓度，分别为０．０３０、０．０１０、０．００３ｍｇ／ｍＬ，取０．１ｍＬ溶液进行喷雾。待叶片表面浮水干后接种小麦白粉病菌孢子。培养１０ｄ后检查，根据每孔病斑数对测定物的杀菌活性进行分级。每个浓度设２个重复，仅对２个重复显示结果不一致的进行复筛。培养条件为温度（２０±1）℃，相对湿度４５％～６５％，光照时间１４ｈ／ｄ，光照度３０００ｌｘ，光源距组织培养板５０～６０cm。

２ 结果与分析

２．１ 不同温度小麦离体叶片的保鲜效果

因在２４孔组织培养板中离体叶片用琼脂保湿并加盖，在各孔室小环境中湿度能保持在饱和状态，所以试验只针对环境温度进行比较。处理７ｄ和１４ｄ的试验结果（表１）表明，在１６℃和２０℃温度下，叶片可以保鲜１４ｄ，综合温度对小麦离体叶片和小麦白粉病菌孢子的影响，确定２０℃为筛选适宜温度。

２．２ 温度、湿度对小麦白粉病发病的影响

２．３ 不同温度对侵染的影响

２．４ 抗真菌剂离体叶片法室内生测稳定性

２．５ 放线菌摇瓶发酵提取物离体叶片法筛选结果

随机选取４８０个放线菌液体摇瓶发酵提取物进行室内离体叶片法筛选，获得活性提取物１２个。目前筛选工作还在继续。

３ 讨论

小麦白粉病的离体叶片筛选法是在叶片喷雾法的基础上，经过微型化而形成的一种高通量、高敏感度的室内筛选方法，这种方法适合于产量低、组分多的微生物源先导化合物的筛选。小麦白粉病室内培养及人工接种技术突破了季节、气候等诸多环境因素的限制，使长年进行有效筛选成为可能。由于离体叶片与大田小麦在生理代谢、生态环境等方面存在差异，对样品的活性反应差异性有待进一步研究。

参考文献：

［１］于基成，刘 秋，魏松红，等．保鲜剂ＭＹ系列在小麦白粉病菌种保存中的应用［Ｊ］．湖北农业科学，２００５，４４（３）：１０１-１０３．

［２］范瑛阁，曹远银，魏松红，等．小麦白粉病潜在生防菌的筛选与控病特性研究［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２００５，３６（５）：５４１-５４５．

［３］袁善奎，马严明，周明国．小麦白粉病菌闭囊壳萌发及其对三唑酮敏感基线的建立［Ｊ］．植物保护，２００１，２７（１）：１-３．

［４］李轲轲，司乃国，刘君丽，等.新杀菌剂氯啶菌酯对小麦白粉病的生物活性［Ａ］．中国植物病害化学防治研究第六卷［Ｃ］．北京：中国农业科学技术出版社，２００８．

［５］ＧＢ／Ｔ１７９８０．２２—２０００，农药田间药效试验准则（一）杀菌剂防治禾谷类白粉病［Ｓ］．