牛支原体生长曲线的测定和培养基筛选

邵倩 储岳峰 何生虎 逯忠新

摘要：为筛选最适于牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）生长的培养基，利用活菌计数方法测定了牛支原体ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基、牛心汤培养基和改良ＫＭ２培养基中的生长曲线。结果发现，牛支原体在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中生长３０ ｈ即可达到平台期，平均最高生长滴度７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ；在牛心汤培养基中生长４０ ｈ即可达到平台期，平均最高生长滴度４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ；在改良ＫＭ２培养基中生长５０ ｈ达到平台期，其平均最高生长滴度为７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ。结果表明，牛支原体在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中生长快、滴度高，为下一步牛支原体灭活疫苗的研究提供了参考依据。

关键词：牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）；培养基筛选；生长曲线

中图分类号：Ｓ８５２．６２；Ｓ８５８．２３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）03－0549-03

Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ

ＳHAO Ｑｉａｎ１，２，ＣHU Ｙｕｅ－ｆｅｎｇ２，ＨE Ｓｈｅｎｇ－ｈｕ１，ＬU Ｚｈｏｎｇ－ｘｉｎ２

（１. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１， Ｃｈｉｎａ； ２. Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒａｚｉｎｇ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ / Ｌａｎｚｈｏｕ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００４６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ， ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｍ． ｂｏｖｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＯＦ２ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ， ｔｈｅ ｃａｔｔｌｅ－ｈｅａｒｔ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ ＫＭ２ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ ｍｅｔｈｏｄ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ｏｆ Ｍ. ｂｏｖｉｓ ａｐｐｅａｒｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｒｕｒｅｄ ３０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ， ４０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔｔｌｅ－ｈｅａｒｔ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ５０ ｈ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｐｒｏｖｅｄ ＫＭ２ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＯＦ２ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ， ４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ ａｎｄ ７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆ Ｍ． ｂｏｖｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＯＦ２ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｄｉａ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｄａｔａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｍ． ｂｏｖｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ； ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ

牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）是引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、角膜结膜炎等病的病原体之一［１］。该病原体于１９６１年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离出来［２］，目前在欧洲和北美洲流行并造成了严重的经济损失［３，４］。２００８年，我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了由Ｍ．ｂｏｖｉｓ引起的以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情，发病率为５０％～１００％，迄今该病原体已在贵州、宁夏、内蒙古、广西、重庆等省、市、自治区被发现［５－８］。疫苗是有效防制动物传染病的重要手段之一，但目前我国尚无有关牛支原体疫苗研究的报道。筛选生长快、滴度高的培养基是灭活疫苗生产工艺研究中的一个重要环节。本试验通过测定牛支原体国内分离株ＯＦ２在不同基础液配方的支原体培养基中的生长曲线，以期筛选出合适的牛支原体制苗用培养基，为下一步牛支原体灭活疫苗的研究奠定基础。

１材料和方法

１．１菌株及培养基

牛支原体ＯＦ２株，２０１０年分离自宁夏某地患肺炎犊牛肺组织，参照文献［５］的方法对其进行特异性ＰＣＲ和１６SＲＮＡ基因测序分析鉴定为牛支原体，本实验室冻干保存。

改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基，配方为：ＰＰＬＯ肉汤（２１ ｇ／Ｌ）、灭活马血清（２００ ｍＬ／Ｌ）、２５％酵母浸出液（１００ ｍＬ／Ｌ）、１０％醋酸铊（１ ｍＬ／Ｌ）、青霉素（０．１ ｇ／Ｌ）、葡萄糖（１ ｇ／Ｌ）、丙酮酸钠（２ ｇ／Ｌ）、０．４％酚红（４．５ ｍＬ／Ｌ）。

牛心汤培养基，配方为：１％水解乳蛋白Ｈａｎｋ＇ｓ液（５６２．５ ｍＬ）、牛心汤（３３７．５ ｍＬ）、马血清（１００ ｍＬ）、２５％酵母浸出液（２０ ｍＬ）、１０％醋酸铊（１０ ｍＬ）、０．４％酚红（１．８ ｍＬ）、青霉素（２０万Ｕ）。

改良ＫＭ２培养基，配方为：ＭＥＭ（５ ｇ）、葡萄糖（０．４ ｇ）、丙酮酸钠（０．２ ｇ）、水解乳蛋白（５．１ ｇ）、灭活马血清（２００ ｍＬ）、２５％酵母浸出液（２０ ｍＬ）、１０％醋酸铊（１ ｍＬ）、０．４％酚红（１ ｍＬ）、青霉素（２０万Ｕ）。

以上所配培养基均用１ ｍｏＬ／Ｌ ＮａＯＨ调ｐＨ至７．４～７．８，４ ℃保存备用。

１．２方法

１．２．１培养基适应性试验取－７２ ℃冻存ＯＦ２株菌种３支，分别接种上述３种培养基进行复苏、传代，根据培养基颜色变化情况记录支原体生长情况。

１．２．２生长曲线测定

１）菌液培养。将－７２ ℃冻存的ＯＦ２菌种移入５ ｍＬ的改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ、牛心汤和ＫＭ２培养基中复苏，复苏后按体积比１∶２０传代约３～５代，待生长稳定后扩大培养到５０ ｍＬ，作为待测菌液，置３７ ℃温箱中培养，从０ ｈ起每隔５ ｈ进行活菌计数。

２）活菌计数与生长曲线绘制。每隔相应的时间从待测菌液取样，采用活菌梯度稀释计数法进行计数。具体方法是：将改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ、牛心汤和改良ＫＭ２培养基各分装于９６孔细胞培养板，每孔２７０ μＬ。第１孔加入待测菌液３０ μＬ，吹打混匀后，取３０ μＬ加入第二孔中，依次重复以上操作至第１０孔，混匀后取３０ μＬ弃去。由此待测菌液被稀释为１０－１、１０－２、１０－３至１０－１０不同的稀释度。每种培养基的操作步骤相同，每个时间点分别做３个平行孔，将细胞培养板置于湿盒中３７ ℃恒温培养，以未接种菌液的培养基为阴性对照，将ｐＨ调至６．８的培养基作为阳性对照。每天观察接种孔的颜色变化，直至孔颜色不发生变化为止，最后一个变色孔的稀释度即为待测菌液的生长滴度，用颜色变化单位（Ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅ ｕｎｉｔ，ｃｃｕ）表示。分别用３份样品的平均滴度（ｘ，ｎ＝３）表示该时间点支原体平均生长滴度。以取样时间点为横坐标，平均生长滴度的对数为纵坐标，绘制生长曲线。

２结果

２．１培养基适应性试验结果

培养试验结果表明，牛支原体ＯＦ２株在３种培养基中均可生长。记录传代稳定后各培养物的颜色变化，结果见表１。从表１可知ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中生长速度快，１２ ｈ即可观察到颜色变化，至３０ ｈ已完全变黄；在牛心汤、改良ＫＭ２培养基中分别需１８ ｈ、２４ ｈ肉眼可见生长（颜色变化）。在３６ ｈ时对培养物进行了计数，结果ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基、牛心汤培养基中生长滴度均可达到１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，而在改良ＫＭ２培养基中仅为１０７ ｃｃｕ／ｍＬ。

２．２生长曲线的测定结果

牛支原体ＯＦ２株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基、牛心汤培养基和改良ＫＭ２培养基中的生长滴度变化见表２，并据此绘制了生长曲线图（图１）。从表２和图１中可以看出，牛支原体ＯＦ２菌株在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中平均生长滴度最高可至７．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，在３０ ｈ左右到达平台期，３０～５０ ｈ之间滴度可维持在１０９ ｃｃｕ／ｍＬ数量级。牛支原体ＯＦ２菌株在牛心汤培养基中最高生长滴度可至４．０×１０９ ｃｃｕ／ｍＬ，在４０ ｈ左右进入平台期，４０～５５ ｈ之间滴度可维持在１０９ ｃｃｕ／ｍＬ数量级。牛支原体ＯＦ２菌株在改良ＫＭ２培养基中生长相对缓慢，在５０ ｈ左右进入平台期，平均生长滴度最高为７．０×１０８ ｃｃｕ／ｍＬ。

３讨论

由于支原体基因组小，自身合成能力较弱，体外培养时所需营养要求高，培养条件较为严格［９］，因此筛选成本较低且利于牛支原体生长的培养基对牛支原体灭活疫苗的研究具有重要的意义。常见的支原体培养基常在３种不同的基础液配方上进行改良而来：ＰＰＬＯ，如Ｅａｔｏｎｓ、Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基等；牛心汤，如Ｈａｙｆｉｌｃｋｓ、Ａ６２培养基和本试验所用的牛心汤培养基等；富含氨基酸和维生素的人工基础液，如Ｆｒｅｙｓ、改良Ｆｒｅｙｓ培养基和改良ＫＭ２培养基等。本实验室此前曾对丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体等支原体最适培养基进行了筛选，发现不同的支原体其最适培养基并不一致［１０］。因此有必要观察牛支原体在这３种不同基础液配方的培养基上的适应情况和生长表现。结果表明，牛支原体在改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中生长快、滴度高，适合于灭活疫苗生产过程中菌体的培养。当然，就所测得的生长曲线而言，本试验结果仅是实验室阶段小量培养得到的数据，在进行中试规模或生产规模的牛支原体培养或发酵罐生产时可作为参考依据，但扩大规模后尚需要进一步进行有关工艺条件的研究。

另外，从培养基材料来源和成本分析，ＫＭ２培养基和Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基中的材料均为商业化试剂，来源方便且质量可控；而牛心汤培养基中的牛心汤目前国内尚未见商品，常由实验室从屠宰场购置后自行制造，除了有生物材料污染的风险以外，没有相关质量标准也不符合当前农业部发布的有关兽用疫苗研制指导原则。因此，从这两方面看，改良Ｔｈｉａｕｃｏｕｒｔｓ培养基应作为牛支原体灭活疫苗研制的首选培养基。

参考文献：

［１］ ＰＦＵＴＺＮＥＲ Ｈ， ＳＡＣＨＳＥ Ｋ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ａｓ ａｎ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｍａｓｔｉｔｉｓ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａ， ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｉｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ， １９９６，１５（４）：１４７７－１４９４．

［２］ ＨＡＬＥ Ｈ Ｈ， ＨＥＬＭＢＯＬＤＴ Ｃ Ｆ， ＰＬＡＳＴＲＩＤＧＥ Ｗ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｏｖｉｎｅ ｍａｓｔｉｔｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］． Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａｎ，１９６２，５２：５８２－５９１．

［３］ ＮＩＣＨＯＬＡＳ Ｒ Ａ Ｊ，ＢＡＫＥＲ Ｓ，ＡＹＬＩＮＧ Ｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｒｏｗｉｎｇ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｃａｔｔｌｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２０００，８：１１５－１１８．

［４］ ＲＯＳＥＮＧＡＲＴＥＮ Ｒ， ＣＩＴＴＩ Ｃ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｕｍｉｎａｎｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ａ］． ＳＴＩＰＫＯＶＩＴＳ Ｌ， ＲＯＳＥＮＧＡＲＴＥＮ Ｒ， ＦＲＥＹ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ ｏｆ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ： ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ， ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ ３［Ｃ］． Ｂｒｕｓｓｅｌｓ： Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，１９９９．１４－１７．

［５］ 石磊，龚瑞，尹争艳． 肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断［Ｊ］． 华中农业大学学报，２００８，２７（５）：６２９－６３３．

［６］ 冉智光，谢建华，骆璐，等． 我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断［Ｊ］．中国预防兽医学报，２０１０，３２（１）：４０－４３．

［７］ 尹灿友． 西昌某牛场疑似牛支原体肺炎ＲＴ－ＰＣＲ方法的诊断［Ｊ］． 西昌学院学报（自然科学版），２０１０，２４（１）：２１－２３．

［８］ 康云． 肉牛支原体肺炎的诊断与防制［Ｊ］． 畜牧兽医杂志，２００８，２９（１）：１３０．

［９］ 毕丁仁， 王桂枝． 动物霉形体及研究方法［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９８．１２２－１３８．

［１０］ 赵萍，储岳峰，高鹏程，等． 丝状支原体山羊亚种最佳培养基的筛选［Ｊ］． 动物医学进展，２００８（１）：２１－２３．

（责任编辑曾德芳）

收稿日期：２０１１－０７－１１

基金项目：甘肃省农业生物技术专项（ＧＮＳＷ－２０１０－０９）；甘肃省科技支撑计划项目（１０１１ＮＫＣＡ０５４）；国家科技基础性工作专项计划

（２００８ＦＹ２１０２００）

作者简介：邵倩（１９８５－），女，宁夏固原人，在读硕士研究生，主要从事畜禽疾病防控技术基础研究，（电话）１３９９５４９５６０３（电子信箱）

Ｓｈａｏｑｉａｎ＿０８１８＠１２６．ｃｏｍ；通讯作者，何生虎，（电子信箱） ｈｅｓｈｅｎｇｈｕ３０８＠１６３．ｃｏｍ；逯忠新，（电子信箱）ｌｕｚｈｏｎｇｘｉｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。