定向诱导基因组局部突变技术研究及应用进展

雷伟侠 黄安群 范志雄 江莹芬 荣松柏 李强生 段晓丽 陈凤祥

摘要：定向诱导基因组局部突变（ＴＩＬＬＩＮＧ）技术是反向遗传学中研究功能基因的一种全新的方法。ＴＩＬＬＩＮＧ技术借助高通量检测手段，快速有效地从突变群体中鉴定出点突变。系统介绍了ＴＩＬＬＩＮＧ技术的基本原理和技术路线，同时总结了ＴＩＬＬＩＮＧ技术本身有待解决的一些问题。

关键词：定向诱导基因组局部突变（ＴＩＬＬＩＮＧ）技术；反向遗传学；点突变；检测

中图分类号：Ｑ７８１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）03－0445-05

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ＴＩＬＬＩＮＧ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＬＥＩ Ｗｅｉ－ｘｉａ１，ＨＵＡＮＧ Ａｎ－ｑｕｎ２，ＦＡＮ Ｚｈｉ－ｘｉｏｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｙｉｎ－ｆｅｎ１，ＲＯＮＧ Ｓｏｎｇ－ｂｏ１，

ＬＩ Ｑｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＤＵＡＮ Ｘｉａｏ－ｌｉ１，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｘｉａｎｇ１

（１． Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｎｈｕｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｅｆｅｉ ２３００３１， Ｃｈｉｎａ：

２． Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００１１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ａ ｎｏｖｅ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｈａｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｔｈｅ ＴＩＬＬＩＮＧ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇy ａｎｄ ｉｔｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｕｔｉｎｅ were introduced． Meanwhile， ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ＴＩＬＬＩＮＧ ｗｅｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）； ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ； ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

诱导突变一直是遗传学发展的主要动力之一。在各种诱变方法中，化学诱变应用特别普遍。化学诱变剂中的烷化剂类能与核苷酸结合，从而造成互补碱基的错配，进而引起复制后的碱基系列改变。例如ＥＭＳ（甲基磺酸乙酯）使鸟嘌呤（Ｇ）烷基化，生成Ｏ６－鸟嘌呤，后者能与胸腺嘧啶（Ｔ）配对而不再与胞嘧啶（Ｃ）配对［１］。适宜浓度的ＥＭＳ诱变具有染色体断裂较少（染色体断裂可引起突变体染色体非整倍化、不育甚至显性致死）、点突变频率高的优点，因此ＥＭＳ的诱变效果通常比较好［１，２］。

化学诱变剂处理后产生的突变多为点突变，其中发生在蛋白质编码区的突变可分为三类：无义突变、沉默突变、错义突变。对于功能基因而言，ＥＭＳ诱导的点突变可产生静息基因（ｎｕｌｌ ａｌｌｅｌｅ或ｓｉｌｅｎｔ ｇｅｎｅ）、条件型等位基因（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅ）或只影响特定的蛋白质结构域，所有这些突变型对阐释目标基因的功能非常有益［３］。

随着大规模测序数据的积累，科学家们对基因组的注意力从基因的结构转向基因的功能，而这就依赖于反向遗传学的发展［４］。反向遗传学研究方法常分为两类，一是特定目标位点的定向诱变，另一个就是全基因组范围内的诱变和筛选。前者常用反义ＲＮＡ抑制或ＲＮＡ干扰（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）来实现，后者常用Ｔ－ＤＮＡ随机插入或转座子标签法来实现［５］。但是，要获得并分析基因组中每个基因的敲除突变体并不容易。目前，对ＲＮＡｉ的研究十分热门，然而ＲＮＡｉ的功效仍旧不明朗，主要表现在后代表型的多样性及不可预见性。同时，由于上述技术均依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，需耗时的转基因和复杂的组织培养技术，作为常规方法加以应用目前仅限于少数物种。当然，还有一些其他研究方法，但都存在不少问题（表１）。因此，在拟南芥等模式生物测序完成后，迫切需要一种新的兼具自动化、适用性广、突变率高的反向遗传学工具用于功能分析。ＴＩＬＬＩＮＧ技术就是在这一背景下应运而生的［６］。

１ＴＩＬＬＩＮＧ技术的原理

ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）技术是美国华盛顿Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ癌症研究中心以Ｓｔｅｖｅｎ为首的科学家发展建立的［７］，它将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与ＰＣＲ筛选技术和高通量检测方法有效结合，以便发现、分析目标区域点突变，是一种全新的高通量、低成本的反向遗传学研究方法。

ＴＩＬＬＩＮＧ技术的原理是先用化学诱变剂诱发产生一系列的点突变，再根据目标基因设计特异性引物，对目标基因进行ＰＣＲ扩增，而后将ＰＣＲ扩增产物变性退火生成错配的异源双链核酸分子，利用仪器分析技术区分出纯合双链和异源双链。为了增加通量，避免假阳性，它将突变群体若干个个体样本的ＤＮＡ混合建池（如拟南芥ＡＴＰ项目组用８个单株建成８倍池），在检测出含突变体的混合池后再对该池中的每个个体分别重新进行ＰＣＲ扩增，验证混合池是否为假阳性并确定对应的突变个体。在明确突变体后，再对目标基因测序，测序结果可以再次验证是否真的为阳性突变。

１．１群体准备

产生适合ＴＩＬＬＩＮＧ技术的诱变群体要求考虑以下因素：目标群体的遗传组成、诱变剂的种类和处理方式、ＤＮＡ提取与建池策略等。

目标群体的遗传组成最好比较简单，首选纯合自交系。并且为了减少亲本个体间的遗传差异，在保证能产生数千子代的前提下，应当选择单个或尽可能少的供体亲本。这方面，有些单倍体育种技术开展得比较成功的作物（如甘蓝型油菜等）无疑具有比较优势。而且只要有可能，供体亲本就应当选择大部分测序信息已经知道的株系或品种。

诱变剂应选择点突变率高的诱变剂。ＥＭＳ由于突变密度高、使用简便可靠而倍受青睐。拟南芥种子ＥＭＳ突变体后代中，点突变随机分布在染色体组上，其中编码区５％突变为编码产物的提前终止突变，５０％为改变编码蛋白氨基酸系列的错义突变［８］。

诱变强度也是考虑因素之一，同样处理的诱变方法在不同物种中的突变率相差很大。诱变会出现致死和不育现象，所以应在突变率、致死率和不育率之间找到平衡。例如果蝇ＥＭＳ诱变剂量为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ时，平均每１５５．６ ｋｂ发生一个突变（１／１５５．６ ｋｂ，下同）；当剂量提高到１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，突变频率增加到１／９０．５ ｋｂ，但Ｆ２存活数从１ ９１５只（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）锐减至１７１只（１２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）［３］。比较已有研究结果中的ＥＭＳ诱发突变的频率，相差最高达４０倍。适宜浓度下最高突变率为六倍体小麦（１／２５ ｋｂ），接下来依次为四倍体小麦（１／４０ ｋｂ）［９］，果蝇（１／１５５．６ ｋｂ）［３］，拟南芥（１／１７０ ｋｂ）［８］，斑马鱼（１／２３０ ｋｂ）［１０，１１］，玉米（１／５００ ｋｂ）［１２，１３］，水稻（１／５００ ｋｂ）［１４］和大麦（１／１．４ Ｍｂ）［１５］，这些数据可能表明影响突变率的是生物体的倍性而不是基因组大小，多倍体生物可能耐受更高剂量的ＥＭＳ。但总体上，诱变处理后变异的分子机理方面的信息还不多，今后这方面的工作可能对改进ＴＩＬＬＩＮＧ技术很有帮助。

１．２ＤＮＡ取样

ＤＮＡ取样受到诱变剂处理方式的影响。植物中最常用的处理方式是将诱变剂配成溶液浸泡种子，这种方式虽然简便，但Ｍ１代突变体常为嵌合体，不能对Ｍ１直接取样，因此，需要将Ｍ１自交得到Ｍ２。在有些大型作物（如玉米）中，为了减少Ｍ２的群体大小，常采用单子传法，但这样会损失２５％的突变体。另外一种较省时的方法是处理植物的花粉后给供体亲本授粉，得到杂合的Ｍ１，这样就可以对每一个Ｍ１单株取样。Ｍ１自交得到的Ｍ２群体实际上是由多个家系构成的，可以提供丰富的遗传信息。利用花粉诱变，Ｔｉｌｌ等［１２，１３］成功获得了由７５０个单株组成的群体，以１１个感兴趣的基因为目标，从中检测出１７个突变体。这个实验可能对其他作物的诱变方式有指导意义。图１表明了两种处理方式的差异［１６］。

为了降低成本，ＴＩＬＬＩＮＧ技术采取类似分子标记筛混合池的策略：将群体中的若干个单株ＤＮＡ样混合作为模板扩增。每个混合池中的样本容量与检测突变的灵敏度间有一个最合适的拐点，超过这个拐点，随着混合池中样本容量的增加，每个池中的杂合双链的比率会减小，检测的灵敏度也因此降低，因此每个物种应当根据倍性找到最适合自己的拐点。Joy等［１７］在对老鼠ＴＩＬＬＩＮＧ的研究中比较了１∶２、１∶５、１∶１０、１∶１５和１∶２０共５组混合池的检测灵敏度，发现１∶１０混合池在灵敏度和成本间达到平衡，而拟南芥ＴＩＬＬＩＮＧ项目组采取８个单株混合的方法，每板ＰＣＲ板因此能检测７８４个（９８×８）单株，检测效率也非常高［６］，混合池也可采用二维点阵法排列［１８］。

１．３引物设计与ＰＣＲ扩增

按目标基因序列设计引物，是ＴＩＬＬＩＮＧ技术的一个重要步骤，设计的好坏直接影响ＴＩＬＬＩＮＧ的筛选效果。Ｎｉｃｋ等专门为拟南芥ＴＩＬＬＩＮＧ项目研究开发了ＣＯＤＤＬＥ程序。ＣＯＤＤＬＥ不仅能识别各种形式的序列信息，按输入的碱基序列产生基因模型和蛋白质保守区域模型，也能列出ＥＭＳ诱导植株产生有害突变的可能范围。当１ｋｂ左右的区段被选中后，研究人员可用Ｐｒｉｍｅｒ３程序设计引物［１９］。

ＴＩＬＬＩＮＧ的ＰＣＲ最适合的退火温度由引物特性来确定，一般可使用Ｐｒｉｍｅｒ３程序给出的最适温度。退火温度一般较高，以保证扩增产物的特异性。如果目标产物的产率不高的话，则可以用巢式ＰＣＲ策略提高产率，如Ｓｙｌｋｅ等［３］用总共１０套引物通过３轮巢式ＰＣＲ成功扩增出了３个不同基因（Ｓａｒａ，Ａｌｐ２３Ｂ和Ａｒｆ６）。

１．４点突变的检测与鉴定

点突变的检测一直是遗传学的一道难题。要得到好的结果，不仅要求检测仪器灵敏度高，还要能够准确识别假阳性位点。对诱变后代目标基因进行测序当然是个可行的办法，但当诱变群体比较大时，对每个后代个体进行测序的成本太高，测序法当然不现实。如果能先利用ＰＣＲ扩增目标基因，再快速区分ＰＣＲ产物，就可以将成本降至最低。现代仪器分析技术与ＴＩＬＬＩＮＧ的结合很好地实现了这一设想。这些技术包括变性高效液相色谱（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）、毛细管电泳（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）和双色红外荧光检测技术，它们主要依赖色谱或电泳时的迁移率不同而实现ＰＣＲ产物的分离。

将酶学技术引入ＴＩＬＬＩＮＧ又一次引起ＴＩＬＬＩＮＧ技术的飞跃。新技术体系是将ＰＣＲ产物先变性，然后复性，如此一来，只要混合池中有一条目标基因的突变链，复性后的双链中就会有一条来自突变型而另一条来自野生型，错配处形成环，此时利用一种特异的内切酶酶切错配碱基［２０］，通过ＤＨＰＬＣ、ＣＥ或凝胶电泳就可以将野生型片段和被切断的突变型片段分开，并且错配碱基被切后的突变型片段长度和被切片段之和应当等于野生型片段长度，突变的位置也可据此判断出来。

Ｃｅｌ Ⅰ是ＴＩＬＬＩＮＧ中常用到的一种错切酶，它是Ｓ１核酸酶家族中的一员。但与其他成员不同的是它更偏好高效切开小的错配ＤＮＡ系列。该酶还具有ＤＮＡ５末端外切酶活性，所以在进行ＴＩＬＬＩＮＧ时应当仔细控制Ｃｅｌ Ⅰ的反应条件以避免它将底物降解［６］。Ｃｅｌ Ⅰ由一家公司商业化生产，价格较高，不少研究者找到了它的替代品。Ｗｕ等［２１］比较了ＭＢＮ（Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）和Ｃｅｌ Ⅰ的错切效率，结果表明所有Ｃｅｌ Ⅰ能切的错配均能被ＭＢＮ切割。而且Ｃｅｌ Ⅰ也可从白菜叶柄或芹菜汁中提取［２２］。

由于色谱柱只是单柱系统，ＤＨＰＬＣ检测一次只能进一个混合样。毛细管电泳技术能一次分析９６个混合池的ＰＣＲ产物，但Ｒａｍａｎ等［２３］比较了毛细管电泳技术和测序技术分析突变体库的效果，却发现当外显子较小、ＳＮＰ频率较高且外显子间有多个内含子的插入／缺失多态性时，ＴＩＬＬＩＮＧ技术应用起来比较麻烦。

而双色红外荧光检测技术则弥补了上述两种检测技术的缺陷。为了用荧光检测技术检测ＣｅｌⅠ酶切产物，事先要在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记引物。杂质、干扰分子在红外光区几乎不发光，所以用红外荧光检测的背景非常低，并且两个通道波长相距较远，几乎无光谱重叠的干扰，从而保证了ＴＩＬＬＩＮＧ分析中每个突变碱基的准确识别及整个检测的灵敏度。Trenton等［２４］在反应体系中加入用ＩＲＤ７００标记的正向引物和ＩＲＤ８００标记的反向引物，扩增产物在平板胶上电泳，然后分别用７００ ｎｍ和８００ ｎｍ两个通道的波长检测，得到两张电泳图，再用ＵＮＩＸ程序“ｇｒａｂ”（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．Ｉｍａｇｅｍａｇｉｃｋ．ｏｒｇ）将ＬＩ－ＣＯＲ扫描仪上的图像文件处理成适合于Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ分析的ＪＰＥＧ压缩文件。

采用荧光标记应当注意两个问题：①引物用荧光标记之后，扩增效率会下降；②ＩＲＤ８００标记的引物活性比ＩＲＤ７００标记的弱，所以８００ ｎｍ通道的信号比７００ ｎｍ的弱。Trenton等［２４］在反应体系中按不同比例混入未标记的引物，其中正向引物标记的与未标记的比例为３∶２，而反向引物比例为４∶１，从而解决了这两个问题。

２Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ：ＴＩＬＬＩＮＧ技术的进一步发展

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ是ＴＩＬＬＩＮＧ技术的变通，只是前者针对自然群体而后者针对诱变后代。自然群体中，Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ ４种碱基均可能发生突变，所以Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ检测出的ＳＮＰ可能发生在目标基因的任一碱基，有别于ＴＩＬＬＩＮＧ时的Ｇ碱基突变。

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ对难以诱变的生物（如某些树木）和人类反向遗传学特别合适。它可以区分群体中目标基因的基因型，也可以分析群体的遗传多样性。当然，这种体系中，应在混合池中加入对照的ＤＮＡ以产生目标基因的杂合双链。如Ｌｕｃａ等［２５］用Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ筛选了哥伦比亚生态型拟南芥１９２个株系，结果发现Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ完全可以有效发现目标基因的ＳＮＰ，结合ＣｅｌⅠ酶切提供的位置信息，可以很容易区分出单模标本（Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）。Ｅｒｉｎ等［２６］收集三角叶杨４１个不同群体，以不列颠哥伦比亚大学植物园的一个群体为对照，确定９个基因为研究对象，调查该树种的遗传多样性，结果发现这些基因中ＳＮＰ从１个至２３个不等，总体上核苷酸多样性相对较低（πｔｏｔａｌ＝０．００１ ８４），作者认为对大范围研究树木自然变异而言，Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ比测序法更有效。人类基因组测序完成后，人们发现个体基因组上核苷酸只有０．１％的差异。但如果要将这０．１％的差异归为人与人不同的根本原因，显然是高估了，因为有些ＳＮＰ并不是功能基因上的多态性。并且，有些ＳＮＰ在人群中并不具有普遍性（普遍性指大于５％），但那些稀有型（小于５％）ＳＮＰ也很可能是遗传病的根本原因，用Ｓａｎｇｅｒ测序法分析这些稀有型ＳＮＰ或发现新的ＳＮＰ效率太低并且成本过高，而Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ可以很好解决这个问题［１８］。

３ＴＩＬＬＩＮＧ有待解决的问题

虽然ＴＩＬＬＩＮＧ是反向遗传学研究领域的一把利器，但在实际应用中有些技术尚需改进。

１）诱变强度（包括诱变剂浓度、处理时间）和处理方式是影响ＴＩＬＬＩＮＧ效果的很重要的因素。如前文所述，不同文章报道的诱变结果相差很大。虽然有多倍体可能更耐ＥＭＳ处理的推测，但针对不同物种何种诱变强度和处理方式最佳，实际工作中常常只能凭经验来确定，今后可能还要在这方面做系统的研究［１６］。

２）突变体的保存也是个问题。对多个功能基因的研究是相当费时的工作，在研究完成前，如何保存突变体？对植物而言，低温保存可以解决这个问题。而对动物来说，就比较难了。Ｓｔｅｍｐｌｅ领导的研究小组收集了６ ０００条斑马鱼用于ＴＩＬＬＩＮＧ计划，如此大的群体，饲养工作和饲养空间无疑增加了实验成本，而且由于寿命限制，还必须在鱼死亡前完成突变体检测和表型验证工作。期间部分个体的死亡不可避免，而这些个体可能就是突变基因的载体［２７，２８］。

３）功能基因的突变与对应突变表型的分析仍然有大量工作要做。一旦点突变被发现后，对那些引起编码蛋白功能损伤的突变就要进行表型分析。但化学诱变引入了大量点突变，使得表型分析变得相对困难。例如ＭａＣａｌｌｕｍ等首次报道了用ＴＩＬＬＩＮＧ研究甲基化酶ＣＭＴ３等位基因，但一年多以后才完成详细的表型分析。ＴＩＬＬＩＮＧ突变体越多，表型鉴定就越慢。而且，除了敲除突变，等位基因还可能有其他差异表达，所以下游工作变得更复杂。在基因组存在大量背景突变的前提下，如何避免把背景突变的表型误检为目标基因的表型，这些问题，就连ＴＩＬＬＩＮＧ领域的权威Ｓｔｅｖｅｎ等人［６］也感到“如同潮水般涌现的基因组测序结果一样，突然出现的大量突变体材料令每个研究人员束手无策”。也许，解决这个问题还得依靠多国科学家共同努力。

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［１６］ ＬＵＣＡ Ｃ，ＳＴＥＶＥＮ Ｈ． ＴＩＬＬＩＮＧ： Pｒａｃｔｉｃａｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００６，４５：６８４－６９４．

［１７］ ＪＯＹ Ｋ，ＪＵＬＩＡＴＩ Ｒ，ＪＯＨＮ Ｓ Ｗ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＬＬＩＮＧ／ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ．ｌｉｃｏｒ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／２００５／Ｔｉｌｌｉｎｇ＿Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ．ｐｄｆ．

［１８］ ＢＲＡＤＬＥＹ Ｊ Ｔ，ＴＲＯＹ Ｚ，ＥＬＩＳＡＢＥＴＨ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒａｒｅ ｈｕｍａｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｂｙ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００６，１３：１－１２．

［１９］ ＲＯＺＥＮ Ｓ，ＳＫＡＬＥＴＳＫＹ Ｈ． Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ［Ｊ］． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１３２：３６５－３８６．

［２０］ ＧＲＡＨＡＭ Ｒ Ｔ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０：１１２５－１１３０．

［２１］ ＷＵ Ｊ，ＳＵＮ Ｒ Ｆ，ＺＨＡＮＧ Ｙ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉ Ｓｃｉ，２００５，９：６５４－６５９．

［２２］ ＹＵＴＡＫＡ ＳＡＴＯ，ＫＥＮＴＡ ＳＨＩＲＡＳＡＷＡ，ＹＯＳＨＩＮＯＢＵ ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ，ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｇａｍｍａ-ｒａｙ －ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｒｉｃｅ ｂｙ ＤＮＡ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｃｌｅａｖａｇｅ ｕｓｉｎｇ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｐｅｔｉｏｌｅ ｅｘｔｒａｃｔ［Ｊ］．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，５６：１７９－１８３．

［２３］ ＲＡＭＡＮ Ｓ，ＭＩＬＴＯＮ Ａ Ｅ，ＭＡＲＹ Ｐ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｙ ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＴＩＬＬＩＮＧ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００６，３９（３）：２２０－２２７．

［２４］ ＴＲＥＮＴＯＮ Ｃ，ＢＲＡＤＬＥＹ Ｊ Ｔ，ＲＡＣＨＥＬ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２００１，１２６：４８０-４８４．

［２５］ ＬＵＣＡ Ｃ，ＫＩＭ Ｙ，ＢＲＡＤＥＬＹ Ｊ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｊ，２００４，３７：７７８－７８６．

［２６］ ＥＲＩＮ Ｊ Ｇ，ＧＥＯＲＧＥ Ｗ Ｈ，ＣＨＥＮＧ Ｃ Ｙ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＳＮＰ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｏｌ ｔｏ ｓｕｒｖｅｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｅｃｏ，２００６，１５： １３６７－１３７８．

［２７］ ＪＡＮＥ Ｂ． Ｓｍａｌｌ ｆｉｓｈ，ｂｉｇ ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｊ］． ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，２：５６８－５７２．

［２８］ ＤＥＲＥＫ Ｌ Ｓ． ＴＩＬＬＩＮＧ—ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ［Ｊ］． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００４，５：１－６．

（责任编辑王贵春）

收稿日期：２０１１－０９－１５

基金项目：安徽省自然科学基金项目（０９０４１１０２１）；安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（１１Ｂ０２０１）

作者简介：雷伟侠（１９７２－），女，陕西合阳人，助理研究员，硕士，主要从事油菜分子生物技术及育种研究工作，（电话）１５８５６９４９６３５

（电子信箱）ｌｅｉｗｅｉｘｉａ２０１０＠１２６．ｃｏｍ。