p38、NF—кB、IL—6在少肌症发生及其运动性缓解中的作用

王今越，王小虹，冯维斗

摘 要：目的：研究p38、NF—_кB、IL—6在少肌症发生及运动缓解少肌症中的作用。方法：24只雄性SD大鼠分为3组，C组（青年安静组）、S组（40 d D—半乳糖注射致衰组）、E组（40 d D—半乳糖注射+6 w跑台运动组）。检测C、S、E组大鼠腓肠肌的质量、Phospho—p38、p38、Phospho—p65、p65、IL—6 mRNA、MRFs （MyoD、MyoG、Myf—5、MRF4）mRNA。结果：与C组相比，S组腓肠肌/体重、Phospho—p65、IL—6 mRNA 降低，Phospho—p38、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA上升，与S组相比，E组腓肠肌/体重、Phospho—p38、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MRF4 mRNA升高；MyoD mRNA/MyoG mRNA比值为S组低于C组，E组高于S组；C组、S组、E组p38及p65均无显著性差异。结论： NF—_кB与IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介导、而p38、MyoD、MyoG、Myf—5（或以p38/ MyoD、MyoG、Myf—5形式）拮抗衰老引起肌肉流失（少肌症）； p38、NF—_кB、IL—6 、MyoD、MyoG、MRF4参与了运动对少肌症的缓解，该过程可能以p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）/ MyoD、MyoG、MRF4通路形式进行；衰老诱导肌肉快—慢转化，运动抑制了该转化趋势；p38、p65表达对运动、衰老不敏感。

关键词：p38；NF—_кB；IL—6；运动；少肌症

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006—2076（2012）04—0051—06

Abstract：Objectvie： Explorer the function of p38， NF—？B and IL—6 in pathogenesis of sarcopenia and it`s exercise—induced improvement. Methods： 24 male SD rats were divided into 3 groups： C group（quiet young group）， S group（40 day D—Glactose injection—induced senecence）， E group（40 days D—Glactose injection—induced senecence +6weeks exercise on treadmill）. It detected the body weight， gastrocnemius weight， Phospho—p38， p38， Phospho—p65， p65， IL—6 mRNA， MRFs（MyoD， MyoG， Myf—5， MRF4）mRNA. Results： There was lower ratio of gastrocnemius weight to body weight， Phospho—p65， IL—6 mRNA， higher Phospho—p38， MyoD mRNA， MyoG mRNA， Myf—5 mRNA in S group than C group. There was higher ratio of gastrocnemius weight to body weight， Phospho—p38， Phospho—p65， IL—6 mRNA， MyoD mRNA， MyoG mRNA， MRF4 mRNA in E group than S group. There is lower or higher ratio of MyoD mRNA to MyoG mRNA in S group than C group or than E group. No change of p38 or p65 in S or E group compared with C group. Conclutions： NF—_кB and IL—6 meditated but p38， MyoD， MyoG， Myf—5 resisted sarcopenia which may be meditated by NF—_кB， IL—6 and resisted by p38/ MyoD， MyoG， Myf—5； p38， NF—_кB， IL—6， MyoD， MyoG， MRF4 contributed to exercise—induced improvement of sarcopenia which may be meditated by p38， NF—_кB， IL—6（or p38/NF—_кB/IL—6）/ MyoD， MyoG， MRF4； Senescence induced “fast to slow” type transformation in skeletal muscle and the transformation was inhibited by exercise. Both p38 and p65 are insensitive to senescence and exercise.

Key words：p38；NF—_кB；IL—6；exercise；sarcopenia

少肌症是一种普遍存在于老年人群的增龄性肌肉质量和力量退行性损失的疾病，它限制人体活动能力，间接加重了多种老年常见症状（II型糖尿病、动脉硬化、骨质疏松），降低了老年人的生活质量，提高了健康成本和社会负担。规律的运动可改善肌肉的结构和功能，对于预防和缓解少肌症作用明显，然而其分子机制，特别是细胞内机制仍然不甚明了。

p38/NF—_кB/IL—6是近年小鼠C2C12细胞研究发现细胞内生肌通路，该通路激活能够上调肌肉特异性基因，对肌肉干细胞分化和成熟肌纤维发育有重要调节作用[1—2]，生肌通路信号的衰减、激活分别通常介导了肌肉萎缩和肥大，而肌肉萎缩、肥大也正分别是少肌症发生和缓解过程的关键事件。笔者推测，p38、NF—_кB、IL—6可能以通路形式介导了少肌症发生及运动对它的缓解过程。目前尚无相关报道。

本研究通过检测运动、衰老（由D—半乳糖诱导）双重干预下大鼠的腓肠肌比重、p38、NF—_кB、IL—6，及生肌因子MRFs（MyoD、MyoG、MRF4、Myf—5）的变化在少肌症发生及少肌症运动性缓解过程中的联系和作用，探索少肌症发生及其运动性干预的机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组及运动方案

购入24只清洁级雄性10 w、250～300 g SD大鼠。适应性训练3 d后随机分组：C组6只、S、E组各9只，次日（周一）执行表1方案。各组大鼠自由进食，国家标准啮齿类动物常规饲料喂养。动物饲养环境温度23℃，湿度40%～60%。

1.2 取材

大鼠以断颈椎方式处死（处死前2 h禁食），称重后取右后腿腓肠肌，用4℃预冷的生理盐水清洗，去处血污，滤纸吸干水分，称重后切分成数段，锡箔纸包裹，做好标签，浸入液氮30 min后放入—80℃超低温冰箱冷冻待测。（注：意外死亡或无法完成运动方案而淘汰大鼠，E组有2只。）

1.3 主要试剂及试剂盒

D—半乳糖，Sigma公司；Phospho—p38 （Thr 180/Tyr 182）抗体与p38抗体（Rabbit，43KD）、Phospho—p65 （Ser536）抗体与p65抗体（Rabbit，65 KD）、tubulin抗体（Rabbit，55KD），cell signaling；Trizol总RNA提取kit，碧云天；Biort RT—PCR assasy kit：博日公司；细胞核蛋白质提取kit：生工公司。

1.4 方法

1.4.1 腓肠肌比重

腓肠肌比重=大鼠右后腿腓肠肌湿重/处死时的体重*（100/%）

1.4.2 Phospho—p38、p38、Phospho—p65 、p65

（1）细胞蛋白提取：取50～100 mg腓肠肌放入小烧杯中，加入1 ml提前预冷的匀浆介质（210 mM甘露醇，70 mM蔗糖，5 mM Tris—HCl，1 mM EDTA，0.1 mM PMSF，0.5 mM DTT，10 mM NaF）。剪碎肌组织，去除结缔组织、脂肪等。电动匀浆，转速1 500～1 800 rpm，使组织匀浆化。匀浆液倒入离心管，1 400 g 4℃离心10 min；吸取上清即蛋白样品，BCA法定量。

（2）western blotting测定上述蛋白含量。一般步骤略，聚丙烯酰胺凝胶浓度10%；抗体稀释（P—p38 1：1000；p38 1：1200；P—p65 1：900；p65 1：1200；tubulin 1：2000）；蛋白表达值为条带的灰度值，以内参tubulin校正。

1.4.3 IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA、MRF4 mRNA

按照Trizol Reagent液说明书提取总RNA，总RNA的质量和纯度检测采用变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光检测OD260/OD280比值，依据质量和纯度选取符合RT—PCR要求的RNA进行逆转录反应。按照Biort RT—PCR kit说明书进行cDNA的逆转录，总RNA经RT反应后进行PCR扩增，采用25μL体系。PCR循环条件： （1）95℃ 5 min，（2）95℃ 30 s，（3）（IL—6：58℃；MyoD：60℃；MyoG：62℃；Myf—5：60℃；MRF4：60℃）40s，（4）72℃ 1 min，（5）回至第2步，25个循环，（6）72℃ 10 min，（7）保持在4℃。 PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶、电泳（上样量12 ul，6 x DNA loading buffer 2 ul，电压150 v，电泳35 min）。mRNA含量为条带的OD值，以内参GAPDH校正。

引物（5–3）如下：（1）IL—6 F：GACTGATGTTGCTGACAGCCACTGC R TAGCCACTGCTTCTGTGACTCTAACT（509kp）；（2）MyoD F：CCCGACGCGTCTCTCTGCTCCTT R： CGCCTGGCGCTGGGTGCA（178kp）；（3）MyoG F： GAGCGCGATCTCCCGTCAAGAGG· R：CTGGCTTGTGCGAGCCCAGG（688kp）；（4）Myf—5 F：GAGCCAGAAGTAGCAGCCTTCG R： GTTCTTTCGGGACACGACAGGG（441kp）；（5）MRF4 F：AGAGACTCGCCAAGGTGGAGATTCR： AAGACTGCTGGAGGCTGGAGCATC（272kp）；（6）GAPDH F：CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT R：AGGGGCCATCCACAGTCTTC（595kp）

1.5 统计学处理

实验数据由SPSS12.0统计软件处理，计算平均值和标准差（x[DD（—*2]—[][DD）]±s）， One—Way ANOVA分析，有显著差异，则SNK法对数据进行组间比较。统计学显著性水平定为0.05。

2 结果

2.1 体重、腓肠肌质量、腓肠肌比重

3 讨论

3.1 衰老、运动对腓肠肌比重影响

本研究表明，腓肠肌比重为S组下降（S组变化均指与C组相较，下同），E组上升（E组变化均指与S组相较，下同）。结果提示，衰老大鼠的肌肉比例下降，而长期规律的运动有其缓解作用，结果符合少肌症发生及其运动性缓解的研究目的。

3.2 衰老、运动对P—p38、p38、P—p65、p65、IL—6 mRNA的影响

p38是骨骼肌发育的主要调节器，成肌细胞中，p38激活是肌肉特异性基因表达、细胞分化的必要前提，成熟肌纤维中，p38激活后也可以通过上调生肌因子MRFs表达、活性及重塑肌肉特异性调节区域组蛋白诱导结构蛋白、功能蛋白表达，促进肌纤维发育[2， 5—6]。以往研究显示，p38总量对理化刺激不敏感，但活性敏感易变，衰老肌肉P—p38（p38活性标志）上调[7—9]，急性运动后，肌肉P—p38一过性上调，24 h内通常可恢复正常[10—11]，长期训练后，P—p38稳定上调[7]。与以往报道一致，本研究显示， S组（vs C组）、E组（vs S组）P—p38均上调，二组p38总量未变（vs C组）。对比可知，P—p38且与腓肠肌比重变化一致。结果提示：衰老肌肉中，p38活性上调拮抗肌肉流失（少肌症），长期训练进一步提高了衰老肌肉p38拮抗少肌症的能力。笔者推测，衰老肌肉p38活性的升高是受ROS、炎症因子上调的影响，而训练后p38活性进一步升高则与胰岛素受体敏感性改善有关，因为以往研究表明，ROS、炎症水平、胰岛素均能激活p38，且前两者随衰老升高，而胰岛素受体敏感性在规律的运动后改善[2， 5—6]。

NF—_кB激活常与炎症、细胞损伤、蛋白降解、组织萎缩相伴随，然而，近年多项离体和体内研究显示NF—_кB对肌肉发生有积极作用，且这个过程受p38调控——IGF—II诱导的L6E9大鼠成肌细胞发生过程中，NF—_кB激活[12]，大鼠2 w跑台运动诱导的腓肠肌肥大幅度可以被NF—_кB阻断所抑制[13]，NF—_кB阻断下调了C2C12细胞某些结构蛋白和功能蛋白的表达，p38阻断后，上述结构蛋白和功能蛋白同样下调，且NF—_кB活性也下调[1]。有研究显示，p38激活能诱导IкB（NF—_кB抑制剂）从NF—_кB分离，提高其活性[14]。Ho提出，持续的NF—_кB激活引起肌肉损伤和流失（如伤病），间歇式的NF—_кB激活促进正常肌肉发育（如运动）[15]。Ho的假设能够较好解释NF—_кB对肌肉作用的矛盾结果，但是没有揭示其原因。转录因子NF—_кB的生物学作用依赖于其靶基因功能，它的靶基因既包括了TNF—α、Il—2等介导炎症基因，也包括Bcl—2、IL—6等抗凋亡或促生肌的基因。笔者认为，NF—_кB矛盾的作用可能是它在不同条件下选择性激活不同功能的靶基因表达所致，该假设有待验证，如确实如此，其选择性机制也是以后研究值得关注的方向。本研究表明， P—p65（NF—_кB活性标志）为S组下降（vs C组），E组（vs S组）升高，两组p65未变（vs C组）。本结果与Song报道[16]一致，该研究报道，衰老大鼠腓肠肌的比重（腓肠肌重量/体重）、NF—_кB活性、Bcl—2/Bax比值降低，12 w跑台后上述指标变化均提高。P—p65与腓肠肌比重变化（S、E组分别为下降、上升）一致，提示，NF—_кB介导了少肌症发生及运动对少肌症的抑制缓解。与P—p38（S、E组均上升）相比，P—p65 S组变化与其相悖，但E组一致，提示，衰老肌NF—_кB活性下降与p38无关，运动引起的NF—_кB活性上调可能受p38支配。

IL—6是NF—_кB靶基因。IL—6对肌肉发育有积极作用——IL—6小鼠的发育明显迟缓，肌肉比例降低[17]。衰老动物循环中IL—6水平升高，但近来研究报道，升高的IL—6源于白色脂肪和单核细胞[18]，衰老肌肉IL—6报道鲜见，仅见Hamada的报道“老年人股外侧肌IL—6 mRNA低于青年人”[19]。急性高强度运动后，肌肉IL—6 mRNA能够上升几十倍，长期运动报道较少且结果较为矛盾，青年大鼠2 w的大强度上坡跑台训练及成年男子10 w的伸膝训练未改变腿肌IL—6 mRNA水平[13， 20]，而虚弱且肥胖的老年人在12 w有氧结合抗组训练后，股外侧肌IL—6 mRNA下降50%[21]。本研究表明，IL—6 mRNA S组降低（vs C组），E组升高（vs S组），与NF—_кB活性变化一致。提示，IL—6可能承继NF—_кB信号，参与少肌症发生及运动对少肌症的缓解过程。本研究“训练上调IL—6 mRNA”的结果与以往报道皆不同，推测可能与测试对象衰老程度、训练方式、训练周期的差异有关。

综上提示：p38拮抗而NF—_кB、IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介导少肌症发生；p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）参与了运动对少肌症的缓解过程。

3.3 衰老、运动对MRFs mRNA的影响

MRFs（MyoD、MyoG、Myf—5、MRF4）是重要生肌效应分子，在成体肌纤维及卫星细胞表达。成体肌纤维中，MRFs与MEF2和E蛋白协同下激活肌肉特异性基因（如α—actin、烟碱乙酰胆碱受体、原肌球蛋白、MHC、结蛋白、肌钙蛋白C、CK、MCK等）转录，促进蛋白更替、肌肉质量及功能提高。肌肉干细胞中，MyoD、Myf—5上调诱导卫星细胞激活、增殖并进入生肌系，MRF4、MyoG上调则引导卫星细胞终末分化[22]。

本研究表明，S组MyoD、MyoG、Myf—5 mRNA均上升，MRF4 mRNA不变，MyoD mRNA/MyoG mRNA降低（vs C组）。提示，MyoD、MyoG、Myf—5参与了少肌症拮抗。本结果与以往Raue、Kim等衰老肌MRFs mRNA上调报道一致[23—24]。Raue认为，衰老肌肉MRFs mRNA的上调意义在于对抗肌肉质量和功能的下降，且其上调是衰老肌肉神经退化所致[23]。MyoD mRNA/MyoG mRNA是快慢纤维比例标志，S组该比值降低表明衰老肌快—慢转化，符合衰老肌肉快肌纤维比例下降更明显的规律。本研究表明，E组MyoD、MyoG、MRF4 mRNA升高，Myf—5 mRNA不变，MyoD mRNA/MyoG mRNA升高（vs S组）。提示：运动能通过MyoD、MyoG、MRF4上调拮抗少肌症；运动抑制了衰老肌肉快—慢的转化。笔者以往研究发现，青年大鼠大强度2 w上坡跑台后，其腓肠肌Myf—5 mRNA上调、MRF4 mRNA不变[13]，该结果与本研究“E组Myf—5 mRNA不变、 MRF4mRNA上调”不同，提示，衰老动物与青年动物MRF4、Myf—5对运动应答的模式可能有较大差异，其机制意义待查，当然也不排除与训练期不同有关（2 w vs 8 w）。也有研究显示一段时间耐力训练后，大鼠肌肉MyoD、MyoG mRNA均降低[25]。一般而言，耐力训练对于肌肉量保持是有益的，生肌因子或者不变，但不应降低，笔者尚不能解释其原因，有待调查，这也表明MRFs调控机制复杂。值得注意的是，本研究无法区分MRFs改变源于成熟肌纤维或卫星细胞，如果源于卫星细胞，那么衰老、运动对少肌症的影响（介导、抑制）分别是卫星细胞抑制、激活的结果，如果源于成熟肌纤维，则分别是成熟肌纤维自身蛋白更替抑制、加强的结果。Raue等曾讨论过类似问题，该研究提出，升高的MRFs应主要源于成熟肌纤维，因为衰老肌肉动员已经缩小的卫星细胞池来对抗肌肉质量功能降低，不如动员大量现成的成熟肌纤维细胞本身蛋白更替有效率，该研究认为，长期训练引起的MRFs改变可能是成熟肌纤维肌及卫星细胞共同作用的结果[23]。该结论有待调查。

联系上述p38、NF—_кB、IL—6改变及MRFs作为重要生肌效应分子和生肌通路重要枢纽的特点，可以推测，衰老肌肉MyoD、MyoG、Myf—5的升高可能与p38活性提高有关，运动引起衰老肌肉MyoD、MyoG、MRF4上调可能是p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式存在）活性或表达上调所致。

4 总结

衰老大鼠腓肠肌的比重、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA降低，Phospho—p38、MyoD mRNA、MyoG mRNA、Myf—5 mRNA上升，长期运动后，衰老大鼠腓肠肌的比重、Phospho—p38、Phospho—p65、IL—6 mRNA、MyoD mRNA、MyoG mRNA、MRF4 mRNA、MyoD mRNA/MyoG mRNA升高。衰老及长期运动大鼠腓肠肌的p38及p65水平未改变。研究提示：NF—_кB与IL—6（或以NF—_кB/IL—6形式）介导、而p38、MyoD、MyoG、Myf—5（或以p38/ MyoD、MyoG、Myf—5形式）拮抗衰老引起肌肉流失（少肌症）； p38、NF—_кB、IL—6 、MyoD、MyoG、MRF4参与了运动对少肌症的缓解，该过程可能以p38、NF—_кB、IL—6（或以p38/NF—_кB/IL—6形式）/ MyoD、MyoG、MRF4通路形式进行；衰老诱导肌肉快—慢转化，运动抑制了该转化趋势；p38、p65表达对运动、衰老不敏感。条件所限，本研究一些问题值得注意：D—半乳糖致衰模型不能完全模拟衰老特征，结论应在天然衰老动物验证；诸因子关联和作用需通过激动剂、阻断剂验证； mRNA不是反映转录因子MRFs功能变化理想指标，未来应该考虑检测它们的DNA结合活性。

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