葡萄组织培养中愈伤组织的诱导

崔鹏

摘要：采用三因素（萘乙酸ＮＡＡ，吲哚丁酸ＩＢＡ，６－苄氨基嘌呤６－ＢＡ）四水平的正交试验设计，对“鄞红”葡萄近梢处的嫩茎段和幼果进行愈伤组织诱导试验。结果表明，６－ＢＡ对愈伤组织诱导影响最大。以嫩茎段为外植体的最佳培养基配方是ＭＳ＋1．00 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０.20 ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，其诱导率为７０．００％。以幼果为外植体的最佳培养基配方是ＭＳ＋０．８0 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１0 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２0 ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ，诱导率为６１．８５％。嫩茎段是“鄞红”葡萄愈伤组织诱导最理想的外植体。

关键词：葡萄；嫩茎；幼果；愈伤组织诱导；正交设计

中图分类号：Ｓ６６３．１；Ｑ８１３．１＋２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0827-03

葡萄是多年生落叶藤本浆果类果树，属葡萄科（Ｖｉｔａｃｅａｃｅ）葡萄属（Ｖｉｔｉｓ Ｌ．）植物［１］。其常规栽培繁殖方法为扦插和嫁接，长期采用导致葡萄品种退化，病害感染率高，严重影响果实产量和品质［２，３］，而组织培养可以达到缩短育种周期、减轻病害和快速繁殖的目的［４］。葡萄叶片和叶柄再生比较困难［１］。李云等［５］对“红地球”葡萄叶片及叶柄进行不定芽诱导，石雪晖［６］对藤稔葡萄叶片、茎段、叶柄和卷须进行离体培养，其诱导率和不定芽分化率均不高。试验所选材料为“鄞红”葡萄，属欧美杂种（Ｖ． ｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．×Ｖ． ｌａｂｒｕｓｃａ Ｌ．），在浙江省栽培范围较广，目前还鲜有关于此品种的组织培养研究报道。通过采用正交试验设计，筛选葡萄愈伤组织诱导的最佳激素浓度配比，以期为该葡萄品种的组织培养和快速繁殖提供有效途径和方法。

１材料与方法

１．１材料

材料取自寧波市江北绿艳果蔬专业合作社葡萄试验基地，以“鄞红”葡萄的嫩茎段与幼果作为外植体。

１．２方法

１．２．１外植体消毒先用自来水洗去外植体表面残留物质，在洗洁精中浸泡１０ ｍｉｎ，再用自来水充分清洗，并用无菌水洗涤一次。然后在体积分数为７０％的乙醇溶液中浸泡４０ ｓ，用无菌水冲洗２～３次，再用1 g/L的HgCl2对外植体处理７ ｍｉｎ，并用无菌水洗涤５～６次。将消毒处理的外植体放在事先灭好菌的滤纸上吸干表面水分，把消过毒的伤口剪掉，然后接种于培养瓶中。

１．２．２试验设计与培养条件于２００９年５月１６日对“鄞红”葡萄近梢处的嫩茎段和幼果进行愈伤组织诱导试验。以ＭＳ为基本培养基，附加２０ ｇ／Ｌ蔗糖，７ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ为５．８～６．０。采取三因素（萘乙酸ＮＡＡ，吲哚丁酸ＩＢＡ，６－苄氨基嘌呤６－ＢＡ）四水平的正交试验，即Ｌ１６（４３）正交设计（表１），进行愈伤组织诱导试验。每个处理接种２０瓶，每瓶６个外植体，重复３次。培养条件为温度２５ ℃，光照时间１２ ｈ／ｄ，光照度２ ０００ ｌｘ，培养７周。

１．２．３统计方法接种后，每隔５～７ ｄ观察记录愈伤组织的生长状况，至２００９年７月１５日统计愈伤组织的诱导率、颜色和质量。数据处理使用ＤＰＳ系统软件对试验结果进行方差分析和显著性检验［７］。

２结果与分析

２．１不同激素配比对嫩茎段愈伤组织诱导的影响

６－ＢＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ对嫩茎段愈伤组织诱导影响的试验结果见表２。１６个处理中，Ｋ处理（ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ）的愈伤组织诱导率最高，达到７０．００％。愈伤组织呈棕黄色，诱导速度比较快，且质量致密（图1）。其次为Ｈ处理（ＭＳ＋０．８０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ），诱导率达到６１．８８％，愈伤组织呈棕黄色，质量也致密。而Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ处理没有愈伤组织产生。由表３的方差分析可以看出，６－ＢＡ、ＮＡＡ和ＩＢＡ不同浓度水平对嫩茎段愈伤组织诱导的影响分别达到显著（Ｐ＜０．０５）或极显著（Ｐ＜０．０１）差异。１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ水平下愈伤组织诱导率极显著高于１．５０ ｍｇ／Ｌ水平，但与０．８０ ｍｇ／Ｌ水平无显著性差异，表明６－ＢＡ浓度过高时不利于愈伤组织诱导。ＮＡＡ在０．１０ ｍｇ／Ｌ水平下愈伤组织诱导率最高，达到４４．４２％，极显著高于０．０５ ｍｇ／Ｌ水平和对照0 ｍｇ／Ｌ水平，但与０．２０ ｍｇ／Ｌ水平无显著性差异，表明ＮＡＡ浓度过低时不利于愈伤组织产生。ＩＢＡ在０．２０ ｍｇ／Ｌ或是０ ｍｇ／Ｌ水平下诱导率较高，分别为４４．４２％和４１．１０％，极显著高于０．１０和０．０５ ｍｇ／Ｌ水平。

因素内水平极差值的大小能够说明该因素对试验结果的影响程度。经表３计算得知，６－ＢＡ对“鄞红”葡萄近梢处的嫩茎段作用影响是最大的，极差为４７．９８，其次是ＮＡＡ和ＩＢＡ，极差均为２７．４９，即３个因素对诱导率的影响的主次关系为６－ＢＡ＞ＮＡＡ＝ＩＢＡ。嫩茎段愈伤组织诱导最佳培养基为ＭＳ＋１．００ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ。

２．２不同激素配比对幼果愈伤组织诱导的影响

从表４可知，不同激素配比对幼果愈伤组织诱导的影响不同。Ｋ处理的愈伤组织诱导率最高，达到６１．８５％，愈伤组织呈浅黄色，质量致密（图２）。其次是Ｊ处理，诱导率为６０．２９％，愈伤组织呈淡黄色。Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ处理则无愈伤组织产生。经表５的方差分析可知，６－ＢＡ、ＮＡＡ和ＩＢＡ不同浓度水平对幼果愈伤组织诱导的影响分别达到显著（Ｐ＜０．０５）或极显著（Ｐ＜０．０１）差异。６－ＢＡ在０．８０ ｍｇ／Ｌ水平下愈伤组织诱导率最高，为４８．６６％，显著高于其他３个水平，表明６－ＢＡ浓度过高或过低均不利于愈伤组织产生。ＮＡＡ在０．１０ ｍｇ／Ｌ水平下诱导率最高，为３７．６０％，其次是０．０５ ｍｇ／Ｌ水平，二者之间无显著性差异。ＩＢＡ在0和０．０５ ｍｇ／Ｌ水平下愈伤组织诱导率较低，极显著低于０．１０和０．２０ ｍｇ／Ｌ水平。同时，根据表５计算得知，６－ＢＡ对“鄞红”葡萄近梢处幼果愈伤组织诱导率的影响作用是最大的，极差值为４８．６６，其次是ＮＡＡ和ＩＢＡ，极差值都是１４．８１，即３个因素对诱导率的影响的主次关系为６－ＢＡ＞ＮＡＡ＝ＩＢＡ。因此，幼果愈伤组织诱导的最佳培养基配方为Ｋ处理，即ＭＳ＋０．８０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．２０ ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ。

３讨论

目前，国内外已有利用葡萄叶片、茎尖和花药［８］等组织器官为材料进行离体培养并获得愈伤组织和芽苗的成功经验，但幼果作为外植体进行愈伤组织诱导还比较少。本试验选取了葡萄嫩茎段和幼果作为外植体诱导愈伤组织，结果发现，嫩茎段的诱导率高于幼果，且诱导时间短，愈伤组织质量优于幼果，因此，对于该品种来说，嫩茎段是其最理想的诱导愈伤组织的外植体。值得注意的是，本试验所用嫩茎段是叶柄与茎的交接处，而非其他部位。

植物愈伤组织诱导产生受多种因素的影响，其中外植体类型、激素种类与浓度配比是其主要影响因素。如果生长素与细胞分裂素的比例适中，对保持愈伤组织的快速生长是非常有必要的［９］。试验中，６－ＢＡ对嫩茎段或幼果愈伤组织诱导均有最大影响，是必不可少的激素。不添加６－ＢＡ，则未能产生愈伤组织。另外，愈伤组织诱导需要６－ＢＡ和ＮＡＡ同时使用，这与宋英今等［１０］阐述的使用安祖花嫩茎诱导时，只有６－ＢＡ和ＮＡＡ的配合使用才有利于愈伤组织诱导的报道相一致。

参考文献：

［１］ 张剑侠，王贺飞，徐炎，等． 中国野生葡萄组织培养研究［Ｊ］． 西北植物学报，２００３，２３（３）：４６０－４６１．

［２］ 张建华，庄天明，孙占刚，等． 华佳８号葡萄离体繁殖技术的研究［Ｊ］． 上海交通大学学报（农业科学版），２００４，２２（３）：３０９－３１２．

［３］ 周鹏，郭安平，王跃进，等． ２个葡萄品系外植体愈伤组织诱导和植株再生［Ｊ］． 热带作物学报，２００２，２３（３）：５２－５７．

［４］ 师校欣，杜国强，贺柱，等． 外植体及培养条件对葡萄不定芽再生的影响［Ｊ］． 果树学报，２００８，２５（４）：５８５－５８８．

［５］ 李云， 冯慧， 田砚亭． “红地球”葡萄叶片、叶柄不定芽再生体系的建立［Ｊ］． 园艺学报，２００２，２９（１）：６０－６２．

［６］ 石雪晖． 藤稔葡萄离体培养研究［Ｊ］．葡萄栽培与酿酒，１９９５（１）：２７－３１．

［７］ 唐启义，冯明光． 使用统计分析及其ＤＰＳ数据处理系统［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００２.４３－５０．

［８］ 高金辉，王玲，张厚良，等． 山葡萄组织培养方法［Ｊ］． 东北林业大学学报，２００７，３５（７）：３７－３９．

［９］ 巩振辉，申书兴． 植物组织培养［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００７． ６８－６９．

［１０］ 宋英今，季静，刘海学，等． 安祖花愈伤组织诱导及其分化的正交试验设计［Ｊ］． 核农学报，２００８，２２（３）：３０２－３０３．