微波辅助提取-HPLC法测定神秘果种子中齐墩果酸

卢圣楼等

摘要：通过微波辅助提取法与超声提取法的比较研究与优化，确定提取神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）种子中齐墩果酸的最佳工艺条件，采用ＨＰＬＣ法测定神秘果种子中齐墩果酸的含量。结果表明微波辅助提取法具有操作简单、提取时间短和提取率高等优点。

关键词：神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）；微波辅助提取法；超声提取；高效液相色谱；齐墩果酸

中图分类号：Ｓ６６７；Ｏ６５７．７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0816-04

神秘果（Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ Ｄａｎｉｅｌｌ）为山榄科神秘属常绿灌木植物，其果实中含有的神秘果素（Ｍｉｒａｃｕｌｉｎ）是一种变味蛋白，果肉在嘴中咀嚼后，再食酸味食物时其味道会转甜［１］。２０世纪６０年代引入我国，在海南、云南、广西等热带、亚热带地区小面积种植。神秘果可用作食品、医药及化妆品等领域的增甜剂、助食剂和食用色素等［２－７］。随着对神秘果研究的不断深入，其营养保健作用也日益受到关注。

近年来，微波辅助提取法（Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＭＡＥ）与超声波提取法（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＵＥ）因具有提取效率高、操作简单方便、无污染、节约能源等优点，在天然产物提取方面得到了广泛应用［８－１２］。本试验分别采用微波辅助提取法、超声波提取法从神秘果种子中提取齐墩果酸，根据齐墩果酸的提取率确定最佳提取方法，并采用ＨＰＬＣ法测定齐墩果酸的含量，旨在为今后神秘果的开发利用提供相关方法。

１材料与方法

１．１材料

神秘果采集于海南省尖峰岭国家森林保护区，经海南师范大学生命科学学院钟琼芯高级实验师鉴定，神秘果种子经电热恒温鼓风干燥箱烘干后，粉碎至６０目备用。

羰基铁粉（Ｃａｒｂｏｎｙｌ ｉｒｏｎ ｐｏｗｄｅｒ，ＣＩＰ）购于陕西兴化化学股份有限公司；齐墩果酸标准品购于四川维克奇生物科技有限公司；正己烷、无水乙醇、三氯甲烷和９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）等均为分析纯，甲醇为色谱纯。

１．２仪器

ＷＲ－Ｃ微波样品处理系统（北京盈安科技有限公司），ＲＥ－５２型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），高效液相色谱仪（日本岛津公司），ＤＨＧ－９２４６Ａ型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），ＴＣＬ－１６Ｇ型电动离心机（上海安亭科学仪器厂），ＵＶ－２４５０型紫外分光光度计（日本岛津公司）。

１．３提取方法

１．３．１超声提取法精确称取神秘果种子粉５．０ ｇ于锥形瓶中，加入５０．０ ｍＬ正己烷溶解，并置于超声波仪中提取４ ｈ，蒸馏回收正己烷，所得浸膏状物质先后用水和氯仿洗涤，合并洗滌液，弃水层，氯仿层再用水洗涤６次，弃水层，挥发氯仿，残余物用甲醇溶解，并定容至１０ ｍＬ，待用。

１．３．２微波辅助提取法精确称取神秘果种子粉２．０ ｇ于烧杯中，用１ ｇ ＣＩＰ与之充分混合后转入微波提取罐内，并添加１５ ｍＬ正己烷，盖上压力盖、密封、放入微波样品处理系统中升温，于１２０ ℃下保持１２ ｍｉｎ后，将提取液全部转移并用少量正己烷清洗内罐，合并清洗液和提取液，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ后，挥干上层清液，用甲醇溶解残余物，定容至１０ ｍＬ，待用。

１．4色谱条件

色谱柱为ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒ２ＳＩＬ Ｃ１８（４．０ ｍｍ × ２００ ｍｍ × ５ μｍ），流动相（甲醇∶水＝９０∶１０，V/V），检测波长为２１５ ｎｍ，柱温为２５ ℃，流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．5齐墩果酸标准溶液的配置

精确称取齐墩果酸标准品３．００ ｍｇ，定容至１０ ｍＬ，并逐级稀释得标准系列溶液。按照上述色谱条件，进样２０ μＬ，以峰面积定量。以齐墩果酸标准品浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，峰面积（ｍＶ*ｓ）为纵坐标绘制工作曲线，得回归方程ｙ＝１ ７７１．６７ｘ＋１２ ８０９ ６００，相关系数０．９９９ ８，ＳＤ＝１８６．５６０ ４，Ｐ＜０．０００ １。结果表明齐墩果酸在０．０１～０．０５ ｍｇ／ｍＬ范围内与峰面积呈良好的线性关系。

２结果与分析

２．１微波辅助提取法与超声提取法的比较

采用微波辅助提取法与超声提取法对神秘果种子中齐墩果酸的提取效果进行比较，其ＨＰＬＣ谱图见图１、图２。由峰面积计算不同方法提取的齐墩果酸含量，结果如表１所示。

从图１、图２及表１可以看出，微波辅助提取神秘果种子中齐墩果酸的效果较好，故后续研究主要分析了微波辅助提取神秘果种子中齐墩果酸的提取条件。

２．２微波辅助提取法单因素试验

２．２．１提取溶剂对提取率的影响分别以正己烷、９５％乙醇（Ｖ／Ｖ）及两者的混合溶液（１∶１，Ｖ／Ｖ）为提取剂进行微波辅助提取实验，研究不同溶剂对神秘果种子中齐墩果酸提取率的影响。

采用上述色谱条件测得提取不同溶剂获得的齐墩果酸含量，结果见表２。由表２可知，正己烷的提取率最高，其次是二者的混合溶液，乙醇的提取效率最低。这表明齐墩果酸在非极性溶剂中有较好的溶解性，故本研究选择正己烷作为提取溶剂。

２．２．２提取时间对提取率的影响精确称取２ ｇ神秘果种子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，按８、１０、１２、１４、１６ ｍｉｎ等５个时间梯度进行微波辅助提取实验，考察不同提取时间对齐墩果酸提取效率的影响。

结果表明，提取时间短，则提取率低，随着提取时间的延长，提取率逐渐增加，但到１２ ｍｉｎ后，增加趋于平缓。另一方面，提取时间的延长也会造成杂质的干扰，所以最终确定１２ ｍｉｎ为最佳提取时间。

２．２．３提取温度对提取率的影响精确称取２ ｇ神秘果种子粉，加入２０ ｍＬ正己烷，分别采用５个不同提取温度（１００、１１０、１２０、１３０、１４０ ℃）进行微波辅助提取试验，结果见图３。从图３可知，提取率随温度升高而增大，至１２０ ℃达到最大值，其后提取率缓慢降低。这可能是随着温度的升高，分子热运动加快，浸出速度也随之加快，但过高温度可能会破坏齐墩果酸结构，也可能是温度过高引起乙醇的挥发，造成溶剂损失。根据本试验结果，最终选择１２０℃为最佳提取温度。

２．３精密度试验

按１．３．２方法前处理，连续进样５次，每次进样２０ μＬ，记录峰面积。结果如表３所示。由表可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ３％，表明本方法的精密度较好。

２．４重现性试验

取同批次样品５份，按１．３．２方法进行前处理，和色谱分析，结果如表４所示。由表4可知，其ＲＳＤ＝０．６２６ ５％，表明本法重现性较好。

２．５ＨＰＬＣ分析

采用ＨＰＬＣ测定不同溶剂提取神秘果种子中的齐墩果酸，利用外标法进行定量，保留时间进行定性，其色谱图见图４～７。

３小结与讨论

通过对神秘果种子中齐墩果酸的提取方法、提取溶剂、提取时间、提取温度等方面的考察，确定了微波辅助提取的最佳条件为：以正己烷为溶剂，液料比１∶１０，在１２０ ℃下，经过１２ ｍｉｎ提取。本试验结果表明，采用该方法的提取率高，提取时间短，为今后神秘果的工业化开发及深入研究提供了技术参考。