酸樱桃中原花青素的分离与纯化

张卓睿等

摘要：以ＮＫＡ树脂为吸附剂，对酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）中原花青素的分离纯化进行了研究。通过单因素试验分析确定了原花青素分离纯化的最佳工艺条件为，上样浓度７ ｍｇ／Ｌ，上样流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，用体积分数为９５％的乙醇溶液作为洗脱剂，以１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速进行洗脱。经树脂纯化后的原花青素通过ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析确定其主要含两种组分，分别为原花青素－３－葡萄糖苷和（－）－表儿茶素没食子酸酯。

关键词：酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）；原花青素；ＮＫＡ树脂；分离；纯化

中图分类号：Ｑ９４９．７５１．８；ＴＱ９１４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）04－0800-04

酸樱桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｃｅｒａｓｕｓ）属蔷薇科李属（Ｐｒｕｎｕｓ Ｌ．）经济树木，其果实中含有丰富的原花青素［１－３］。原花青素（Ｐｒｏｃｙｎｉｄｉｎｓ，简称ＰＣ）是一大类多酚类化合物的总称，是由儿茶素、表儿茶素及表儿茶素没食子酸酯通过Ｃ４－Ｃ６或Ｃ４－Ｃ８连接而成的不同聚合度的混合物［４］。

原花青素具有较强的抗氧化作用，以及明显地抑菌、消炎、抗癌、抗老化和抑制胆固醇上升等功效，摄取一定量原花青素能够有效地预防和抑制疾病的发生［５－９］。目前，原花青素已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用，随着天然产物生产加工的逐渐兴起，原花青素更成为天然产物和有机化学的研究热点［１０－１３］。不过，对于酸樱桃果实中原花青素的开发利用，目前国内尚处于起步阶段，还未见相关报道，因此，从酸樱桃果实中提取原花青素并进行分离纯化的研究具有较大的开发潜力和实用价值。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料与试剂酸樱桃：吉林市九站试验基地提供；ＮＫＡ树脂：南开大学化工厂生产；无水乙醇、甲醇、甲酸、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯。

１．１．２主要仪器与设备循环水式多用真空泵（ＳＨＢ－Ｂ９５）：郑州长城科工贸有限公司；恒温水浴锅（Ｂ－２６０）：上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发器（ＲＥ５２ＣＳ－１）：上海亚荣生化仪器厂；真空冷冻干燥机（ＦＤ）：北京博医康仪器有限公司；高速冷冻离心机（ＳＣＲ２０ＢＣ）：日本日立公司；电子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）：上海精密科学仪器有限公司；ＵＶ－２５０１ ＰＣ型分光光度计：日本岛津公司；Ｗａｔｅｒｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＺＭＤ４０００液质联用仪；Ｗａｔｅｒｓ ２６９０液相色谱仪（包括梯度泵、自动进样器等）；Ｗａｔｅｒｓ ９６６二极管阵列检测器。

１．２方法

１．２．１原花青素的测定方法采用盐酸－香草醛法［１４］。

１．２．２原花青素提取液的制备方法酸樱桃经清洗、去核后，用胶体磨处理１５ ｍｉｎ，按溶剂与物料质量比１∶４加入体积分数为７０％的乙醇，在６０ ℃下冷凝回流提取２次，每次４ ｈ。合并两次提取液，冷冻干燥后得原花青素提取液。

１．２．３原花青素萃取分离的方法提取液中的脂类等杂质不利于纯化分析，因此，须对提取液进行萃取分离。①脱脂：向提取液中加入３倍体积的石油醚，混匀，在分液漏斗中静置至分层，放出下层溶液，所放出溶液再重复一遍脱脂操作；②萃取分离：向脱脂后的提取液中加入２倍体积的乙酸乙酯，混匀后在分液漏斗中静置至分层，除去下层溶液保留上层溶液，将上层溶液重复此操作３次，最后蒸馏浓缩除去乙酸乙酯，得到原花青素萃取液。

１．２．４NKA树脂吸附的方法

１）NKA树脂的预处理。将NKA树脂在无水乙醇中浸泡２４ ｈ，除去树脂中杂质，然后湿法装柱。装好后，用去离子水以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速冲洗树脂柱，直到无乙醇残留；以同样的流速，将０．０５ ｇ／Ｌ的ＨＣｌ通过树脂柱，２ ｈ后再以去离子水洗至中性，接着以２.0 ｍＬ／ｍｉｎ的流速，将０．０５ ｇ／Ｌ的ＮａＯＨ水溶液通过树脂柱，２ ｈ后再以去离子水洗至其洗出液至中性，备用。

２）最佳上样流速的确定。称取３份已处理好的树脂各２ ｇ，分别以流速０．５、１．０、２．０ ｍＬ／ｍｉｎ通入原花青素萃取液，每间隔２ ｍＬ测定流出液吸光值，根据结果确定最佳上样流速。

３）最佳上样浓度的确定。将等量原花青素萃取液稀释成不同浓度，然后以最佳上样流速分别通入树脂柱。通过比较吸附前后其吸光值的变化，利用（Ａ０－Ａ１）／Ａ０×１００％计算出吸附率，其中Ａ０为上样液的吸光值，Ａ１为样品全部通过树脂柱后流出液的吸光值。

４）最佳洗脱流速的确定。称取２份已处理好的树脂各２ ｇ，分别以最佳上样流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，进样完毕后，依次用体积分数为５０％的乙醇溶液以１.0、２.0 ｍＬ／ｍｉｎ洗脱，每间隔２ ｍＬ测定洗脱液的吸光值，直至洗出液为无色时为止，根据结果确定最佳洗脱流速。

５）最佳乙醇体积分数的确定。称取５份已处理好的树脂各２ ｇ，分别以最佳上样流速通入原花青素萃取液１０ ｍＬ，进样完毕后，按照最佳洗脱流速，依次用去离子水、体积分数为３５％、５５％、７５％、９５％的乙醇溶液洗脱，至洗出液为无色时为止，测定洗脱液的吸光值，确定最佳的乙醇体积分数。

１．２．５纯化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析法树脂流出的洗脱液在４０℃旋转蒸发除去溶剂，之后在－６０℃条件下冷冻干燥，得到暗红色油状物（该物质溶于甲醇），再经０．４５μｍ膜过滤后用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析。

色谱条件：色谱柱Ｚｏｒｂａｘ ＸＤＢ（５ μｍ，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ）；流动相Ａ.甲酸－水（甲酸∶水＝１∶９９，Ｖ／Ｖ），Ｂ.甲醇－甲酸－水（甲醇∶甲酸∶水＝８０∶１∶１９，Ｖ／Ｖ／Ｖ）；按小于５ ｍｉｎ、１００％（Ｖ／Ｖ）Ａ，５～５０ｍｉｎ、２０％（Ｖ／Ｖ）Ａ＋８０％（Ｖ／Ｖ）Ｂ，流速１.0 ｍＬ／ｍｉｎ进行梯度洗脱。柱温３０ ℃，进样量２０ μＬ，检测分流比５∶１。

质谱条件：扫描方式——负离子扫描（ＥＳＩ，ｍ／ｚ ２６０～１ ５００），毛细管电压４．２ ｋＶ，锥孔电压５０ Ｖ，光电倍增器电压６５０ Ｖ，离子源温度１２０ ℃，脱溶剂气温度３００ ℃。

２结果与分析

２．１ＮＫＡ树脂的分离与纯化

２．１．１最佳上样流速的确定根据测定结果，以流出液的体积对应流出液的吸光值作图，得到不同上样流速下的吸附曲线，如图１所示。由图１可见，上样流速为２．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，流出液在３ ｍＬ后吸光值即开始急剧增加，泄露点出现过早，所以样品中的原花青素未能及时扩散到树脂内部和树脂达到吸附平衡就流出，吸附量较少；上样流速为０．５ ｍＬ／ｍｉｎ时，流出液在７ ｍＬ后才出现泄露点，原花青素有充分的时间进入树脂内部而被吸附分配，吸附性较好，但流速慢，吸附时间过长；而上样流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时的吸附曲线与０．５ ｍＬ／ｍｉｎ的非常接近，说明二者的吸附效果相差不大。因此综合考虑，本研究选择１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上样流速，既有较高的吸附性又可提高分析效率。

２．１．２最佳上樣浓度的确定上样浓度对NKA树脂吸附效果的影响见图２所示。由图２可见，随着上样浓度的增加，吸附率先升高后降低。在上样浓度为７ ｍｇ／ｍＬ时，吸附率最高；之后，随着上样浓度的增加，吸附率反而下降，其原因可能是由于当上样浓度过大时，会发生多层吸附，而且易堵塞树脂，影响吸附效率。因此，确定最佳上样浓度为７ ｍｇ／ｍＬ。

２．１．３最佳洗脱流速的确定根据测定结果，以洗脱液体积对应洗脱液的吸光值作图，得到不同洗脱流速下的洗脱曲线，如图３所示。从图３可以看出，洗脱流速越低，吸附树脂和洗脱剂之间接触时间越长，相互作用越充分，能较好地将原花青素从NKA树脂中解吸出来，洗脱流速越高，洗脱时的脱尾现象越明显，洗脱相同量的原花青素所需的洗脱剂越多。当洗脱流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ时，洗脱高峰比较集中，洗脱剂用量少，脱尾现象不明显，且较好地解吸了被树脂吸附的原花青素。因此本研究选择１．０ ｍＬ／ｍｉｎ作为洗脱流速。

２．１．４最佳乙醇体积分数的确定根据测定结果，以乙醇体积分数对应洗脱液吸光值作图，得到如图４所示的曲线。由图４可以看出，随着乙醇体积分数增加，洗脱液吸光值不断增大，说明解吸率不断增大，当乙醇体积分数达到９５％时，解吸效果最好，所以本研究中采用体积分数为９５％的乙醇溶液进行洗脱。

２．２纯化后原花青素的ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析

经ＮＫＡ树脂纯化后的原花青素通过ＨＰＬＣ分析，得到了如图５Ａ所示的色谱图。由图可见，纯化物中主要含有两种单体组分Ｍ１和Ｍ２（其保留时间分别为１２．８２８、１４．９７３ ｍｉｎ），其对应的ＥＳＩ-MS质谱图如图５Ｂ、５Ｃ所示。

从图５Ｂ可知，组分Ｍ１的分子离子峰为４５３．１（Ｍ＋１），确认该化合物的分子量为４５２，与原花青素－３－葡萄糖苷分子量一致，因此推断组分Ｍ１为原花青素－３－葡萄糖苷，其结构如图６。

从图５Ｃ可知，组分Ｍ２的质谱图中含有（－）－表儿茶素没食子酸酯的分子离子峰４４１．２（Ｍ＋１）、失去没食子酰基形成的离子峰２８９．３和其他一些碎片离子信息，因此推断组分Ｍ２为（－）－表儿茶素没食子酸酯，其结构如图７。

３结论与讨论

ＮＫＡ树脂对原花青素具有较好的吸附和解吸能力，是分离酸樱桃中原花青素较理想的吸附剂。经试验分析，得到以下结论。

１）上样流速为０．５ ｍＬ／ｍｉｎ时吸附性最好，但分析时间过长，而１．０ ｍＬ／ｍｉｎ的上样流速与其吸附效果相差不大，因此，本研究选择１．０ ｍＬ／ｍｉｎ为上样流速，既有较高的吸附性又可提高分析效率。

２）上样浓度越大，树脂吸附量越多，吸附率越高，但如上样浓度过高，又可能导致多层吸附，且易堵塞树脂，影响吸附效率。根据吸附曲线，确定最佳上样浓度为７ ｍｇ／ｍＬ。

３）洗脱流速越低，吸附树脂和洗脱剂之间接触时间越长，相互作用越充分，能较好地将原花青素从NKA树脂中解吸出来，洗脱流速越高，洗脱时的脱尾现象越明显，洗脱相同量的原花青素所需的洗脱剂越多。所以选择１．０ ｍＬ／ｍｉｎ流速作为洗脱流 速。

４）乙醇体积分数对原花青素的解吸效果有也较大的影响，当乙醇体积分数为９５％时解吸效果最好，所以本研究中采用体积分数为９５％的乙醇溶液进行洗脱。

５）分离、纯化后的原花青素经ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ分析，确定其主要含两种组分，分别为（－）－表儿茶素没食子酸酯和原花青素－３－葡萄糖苷。

通过试验分析，确定了树脂分离、纯化酸樱桃中原花青素的最佳工艺条件，并利用ＨＰＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ定性了纯化物的主要成分，为酸樱桃中原花青素的进一步开发利用奠定了基础。

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